微生物基因工程（第六章-3）.ppt

凝胶介质的选用原则 分级分离 将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分 离叫分级分离,该策略是使高分子物质完全被排阻，小 分子物质完全渗入凝胶内。 分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子 量物质的凝胶在层析过程中，样品中各组份均能不同 程度地深入到凝胶内部，但由于深入凝胶空隙程度上 的差异，最后得到分离。 凝胶层析的基本操作 层析柱平衡 平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速 注意凝胶的断层和气泡 操作压控制 平衡和洗脱时应维持流速恒定 恒定的操作压是恒流的先决条件 凝胶层析的基本操作 进样体积 上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定： 进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的10% 进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能窄，这样洗脱出的峰形好 D 亲和层析 亲和层析的基本概念 亲和层析载体的性质与选择 亲和层析配基的性质与选择 亲和层析的基本操作 亲和层析的基本概念 亲和层析的基本特点 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特 异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术，它有 如下特点： 纯化过程简单、迅速，且分离效率高 特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子 纯化倍数大，产物纯度高 必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件因此应用范围受到一定的限制 亲和层析的基本概念 具有特异性亲和作用的生物分子 抗原与抗体 DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA)) 酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子 激素或药物与其受体 维生素于其特异性结合蛋白 糖蛋白与其相应的植物凝集素 亲和层析的基本概念 亲和层析的基本原理 亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂 当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出 然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来 亲和层析载体的性质与选择 亲和层析载体的选择 具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过 具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速 具有惰性，尽量减少非专一性吸附 具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价合偶联 在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性 亲和层析载体的性质与选择 常用的亲和层析载体 纤维素 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 其它新型载体 亲和层析配基的性质与选择 亲和层析配基的选择 纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力 但亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的条件就要强烈，这样可能使生物分子变性 配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与生物分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响配基与生物分子之间的亲和力 亲和层析配基的性质与选择 配基的偶联 酸酐法 N-取代羟基琥珀酰亚胺法 叠氮化作用 还原性烷基化合物（西夫碱）的形成 亲和层析的基本操作 非专一性洗脱 通常采用改变pH、离子强度、离子种类或者温度等 使与固定配基结合的生物大分子的构象发生变化，降 低其亲和力，但使用较广泛的是改变溶液的离子强度。 非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分 子的构象发生变化，而是洗脱剂中的某一组分与固定 配基形成复合物，使固定化的配基对相应的生物大分 子的亲和力降低 亲和层析的基本操作 专一性洗脱 使用特异的配基作为洗脱剂 使用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合来洗脱目标产物 第六章 外源基因的表达（三） 6.1 基因表达的机制 6.2 基因表达的调控元件 6.3 影响外源基因表达的因素 6.4 外源蛋白的融合表达及分泌表达 6.5 大肠杆菌基因表达系统 6.6 酵母基因表达系统 6.7 哺乳动物基因表达系统 6.8 外源基因表达产物的分离纯化与检测 8 外源基因表达产物的分离纯化 A 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 B 离子交换层析 C 凝胶层析 D 亲和层析 E 膜分离 F 原核生物表达的重组蛋白质量检测 A 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 针对不同的产物表达形式采取不同的策略 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 多种分离纯化技术的联合运用 合适分离纯化介质的选择 分离纯化过程的规模化 针对不同的产物表达形式采取不同的策略 采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度 低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行 浓缩处理； 采