H9N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆表达及反应原性分析.docVIP

PAGE 590 中 国 农 业 科 学 41卷 2期 王方昆等：H9N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆表达及反应原性分析 PAGE 591 中国农业科学 2008,41(2):587-592 Scientia Agricultura Sinica 收稿日期：2006-11-08；接受日期：2007-07-06 基金项目：浙江省科技计划重点项目（2004C22044） 作者简介：王方昆（1980-），男，山东泰安人，硕士研究生，研究方向为动物传染病。通讯作者刘思当（1961-），男，山东泰安人，教授，博士，研究方向为动物临床病理学。Tel：0538-8249526；Email：liusid@ H9N2亚型猪流感病毒NS1基因的克隆表达及反应原性分析 王方昆1,2，袁秀芳2，王一成2，张 存2，徐丽华2，刘思当1 （1山东农业大学动物科技学院，山东泰安 272018；2浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，杭州 310021） 摘要：【目的】对H9N2亚型猪流感病毒NS1（nonstructural protein 1）基因进行原核表达，获得纯化表达产物，以期为检测猪流感抗体的 ELISA试剂盒的研制奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增了猪流感病毒（H9N2）的NS1基因，将其克隆于表达载体pET-28a（+）上构建成重组质粒pET-NS1，转化受体菌E.coli BL21-DE3感受态细胞，经酶切鉴定及序列分析，筛选出正确重组质粒转化子。【结果】经终浓度5 mmol·L-1乳糖诱导，SDS－PAGE电泳结果显示，重组蛋白NS1得到大量表达，分子质量约为26kD。经Western-blotting分析，表达蛋白能与阳性血清发生特异性反应，而与阴性血清不反应；ELISA检测显示，在被检血清稀释1 280倍时，阳性血清的OD650值大约是阴性血清的3倍，差异明显。【结论】重组蛋白NS1表达量高，易于纯化并且具有良好的血清学反应的特异性。 关键词：猪流感病毒；NS1基因；反应原性 Cloning, Prokaryotic Expression and Antigenicity Analyzing of NS1 Gene of H9N2 Swine Influenza Virus WANG Fang-kun1,2, YUAN Xiu-fang2, WANG Yi-cheng2, ZHANG Cun2, XU Li-hua2, LIU Si-dang1 (1College of Animal Sciences and Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Taian 271018, Shandong; 2Insititute of Animal Sciences and Veterinary Medicine, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021) Abstract: 【Objective】The NS1 gene of H9N2 subtype influenza A virus was expressed in prokaryotic expression system to obtain recombinant protein. 【Method】The NS1 gene of H9N2 subtype influenza A virus was amplified by RT-PCR, and then cloned into prokaryotic expression vector pET-28a (+).The recombinant plasmid pET-NS1 was extracted after being transformed into E.coli BL21-DE3 competent cells. Restriction enzymes digestion and sequences analysis demonstrated that the recombinant plasmid carrying NS1 was inserted into correct open reading frame. 【Result】The recombinant protein of NS1 about 26 kD was produced after induction with 5 mmol·L-1 lactose.The western-blotting te