分子标记的实验原理及操作流程.docVIP

一 AFLP 分子标记实验 扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism(AFLP 是在随机扩增多 态性 (RAPD 和限制性片段长度多态性 (RFLP 技术上发展起来的 DNA 多态性检测技术, 具有 RFLP 技术高重复性和 RAPD 技术简便快捷的特点, 不需象 RFLP 分析一样必须制备探针, 且与 RAPD 标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征,同时弥补了 RAPD 技术重复性差的缺陷。 同其他以 PCR 为基础的标记技术相比, AFLP 技术能同时检测到 大量的位点和多态性标记。 此技术已经成功地用于遗传多样性研究, 种质资源鉴定方面的研 究,构建遗传图谱等。 其基本原理是:以 PCR(聚合酶链式反应 为基础, 结合了 RFLP 、 RAPD 的分子标记技术。 把 DNA 进行限制性内切酶酶切,然后选择特定的片段进行 PCR 扩增 (在所有的限制性片段两 端加上带有特定序列的 “ 接头 ” , 用与接头互补的但 3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行 特异 PCR 扩增, 只有那些与 3-端严格配对的片段才能得到扩增 , 再在有高分辨力的测序胶上 分开这些扩增产物,用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。 一、 实验材料 采用青稞叶片提取总 DNA 。 二、 实验设备 1. 美国贝克曼库尔特 CEQ8000毛细管电泳系统, 2. 美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机, 3. 美国 MJ 公司 PCR 仪, 4. 安玛西亚电泳仪等。 三、 实验试剂 1. 试剂:请使用高质量产品,推荐日本东洋坊 TOYOBO 公司的相关产品。 DNA 提取试剂盒; EcoRI 酶,MseI 酶,T4连接酶试剂盒; Taq 酶,dNTP, PCR reaction buffer; 琼脂糖电泳试剂:琼脂糖,无毒 GeneFinder 核酸染料替代传统 EB 染料; 超纯水(18.2M ? ·cm 2.其他实验需要物品 微量移液枪(一套及相应尺寸 Tip 头,PCR 管,冰浴等。 四、 实验流程 1、 总 DNA 提取 使用 DNA 提取试剂盒提取植物基因组 DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑 胶检测。一般来说, 100ng 的基因组 DNA 作为反应模板是足够的。 2、 EcoR1酶消化 (20ul 体系 /样品 EcoR1 1ul 10×Buffer 2ul 37℃ 65℃ 30min终止反应 sample(总 DNA 5ul ddH 2O 12ul 3、 Mse1酶消化 (20ul 体系 /样品 Mse1 2ul (1U/ul 10×Buffer 2ul sample(EcoR1酶切产物 80℃ 30min终止反应 ddH 2O 1ul 4、 T4 DNA Ligase(20ul 体系 /样品 T4 DNA Ligase 2ul(1U/ul 10×Buffer 2ul sample(双酶切产物 10ul Mse1 Adaptor 1ul 2265℃ 10min终止反应 EcoR1 Adaptor 1ul ddH 2O 4ul 5、 预扩增 (20ul 体系 /样品 sample 4ul Primer(Mse1/EcoR1 1ul AFLP Core Mix 15ul * AFLP Core Mix 配方: ddH 2O 13.8ul MgCl 2 1.6ul dNTPs(2.5mM 1.6ul Taq 酶 (1U/ul 1ul 10×Buffer 2ul 预扩增程序: 94℃ 2min 94℃ 56℃ 72℃ 2min 60℃ 30min 6、选择性扩增 (20ul 体系 /样品 sample 4ul(预扩增产物稀释 20倍 Primer(Mse1-XXX/EcoR1-XXX 1ul AFLP Core Mix 15ul 选择性扩增程序: 94℃ 2min 94℃ 20s 66℃ 30s 每循环降 1℃,共 10个循环 72℃ 2min 94℃ 20s 56℃ 30s 20个循环 72℃ 2min 60℃ 30min 7、产物电泳检测 上样液:Loading Buffer 20ul Size standard-600 0.2ul Sample 3ul(稀释 10倍 四、实验结果与分析 本实验使用贝克曼库尔特 (BeckmanCoulter 公司 CEQ8000遗传分析系统, 运用先 进的荧光标记技术和毛细管电泳分离技术进行实验, 扩增产物在高分辨率毛细管中电泳 分离,采用激光激发荧光采集数据,灵敏度极高,电泳结果通过软件自动统计分析并转 换成“ 0、 1”矩阵,便于对结果进一步深入分析研究,整个电泳、数据采集和数据分析 过程由软件来控制完成,