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动物体内过氧化物酶活性的测定 廖百建 1、原理 过氧化物酶 过氧化物酶[perox idase, POD] 广泛存在于各种动物体内。催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应: RH2+ H2O2→2H2O + R 通过测定420nm处吸光度的变化得出酶的活性 2　POD 分子结构特点 POD 是一种由单一肽链与卟啉构成的血红素蛋白, 脱辅基蛋白分子须与血红素结合才构成全酶。 3、POD的主要生理功能 参与活性氧代谢过程； 注：除了与动物正常代谢和生长发育相关的结构型POD 外, 很大部分POD的合成属于诱导表达型。 4、实验材料与试剂 实验材料： 蝗虫的幼虫 420nm的分光光度计 恒温水浴箱 试剂 试剂一：60ml液体*4瓶，4℃保存6个月。 试剂二;粉剂*3瓶，4℃保存6个月。 试剂二应用液的配制：临用每瓶粉剂加入10ml的双蒸馏水溶解，4℃保存避光 试剂三：5ml瓶液*1瓶 4℃保存6个月。 试剂三应用液的配制：临用前用蒸馏水15倍稀释，使得1cm光径，双蒸馏水调零时A240保持在0.4左右，现用现配。若A值太高，则加双蒸馏水稀释，若A值太低，则加入适量试剂三。（一般在25倍左右稀释） 试剂四：50ml液体*2瓶，4℃保存6个月 5、实验步骤 前处理 蝗虫幼虫匀浆的制备，准确称取幼虫的重量，按照重量（g):体积（ml)=1:9的比例加入9倍体积的匀浆介质（建议使用生理盐水或磷酸盐缓冲液：0.1mol/l PH 7~7.4) 冰浴下制备成10%的幼虫匀浆液，4000转/分离心10分钟后，取上清420nm处，1cm光径。100ul进行OD值的测定 测定管 对照管 试剂一（ml) 2.4 2.4 试剂二应用液(ml) 0.3 0.3 试剂三应用液（ml) 0.2 双蒸馏水（ml) 0.2 样本 0.1 0.1 37℃水浴准确反应30分钟 试剂四（ml) 1.0 1.0 2.操作表 6、计算酶活性 选取OD值变化较均匀的一段数据，代入公式计算； 以每分钟OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活力单位（U）。 酶活力=（测定OD值-对照OD值）*反应总体积(ml)*1000/12*比色光径（cm)*取样量(ml)*反应时间（30分钟）*匀浆蛋白浓度(mgport/ml) 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。。 3．??封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 4．底物请避光保存。 5．试验结果判定必须以酶标仪读数为准. 6．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 7．本试剂不同批号组分不得混用。 7.注意事项