仿生明胶甲基丙烯酰胺水凝胶支架的骨组织工程研究-人体解目剖与组织胚胎学专业毕业论文.docxVIP

硕士学位论文我们的研究内容主要包括如下三个章节 硕士学位论文 我们的研究内容主要包括如下三个章节 第一章仿生明胶甲基丙烯酰胺水凝胶支架的合成及表征 【目的】 通过热致相分离技术(TIPS)，制造出粗糙表面和多孔侧壁形貌的 Bio．GelMA。 【方法】 GelMA的合成方法： 将10％(w／v)N胶溶于50。C习2蒸水中，搅拌直至完全 溶解。将甲基丙烯酸酐加入明胶溶液体系内，让其在50C反应条件下反应3小 时。随后，在混合物透析袋内透析并用中性滤纸过滤。最后，过滤后的GelMA 溶液放入．80C冷冻，冷冻干燥，并存储于室温下待用。通过1H NMR评价接枝 反应。 TIPS技术合成3D的GelMA支架：首先，将冷冻干燥的GelMA(1．259) 溶于25rrd，40℃双蒸水中，并加入引发齐H：1％(wM过硫酸铵(APS)及0．2％(v／v) N，N，N，N-四甲基7,--胺(Ⅱ㈣)；随后，依次将混合物放入．20C，12小时和 ．80℃，48小时冷冻。交联成胶后，用自制打孔器裁剪成大小一致的样品(长 10ram，宽8mm，厚度大约1．5ram),然后，使用冰冻切片机切除材料的表皮； 最后，冷冻干燥。使用扫描电子显微镜(SEM)观察冷冻干燥的水凝胶支架的 形貌。 【结果】 明胶甲基丙烯酰胺的核磁共振波谱显示在5．3ppm和5．6ppm处有波峰，即 丙烯酰胺双键波峰所在位置，丙烯酰胺基团取代率为53％。 支架材料的SEM观察结果：Bio．GelMA支架具有低密度、高孔隙率和空隙 互相连通的特点。通过Image J软件计算Bio．GelMA的孔隙率为85％。Bio．GelMA 支架的孔径大约100～500姗。更重要的是，与传统GelMA支架光滑的侧壁相 比，Bio．GelMA支架材料的侧壁含有很多孔隙，互相交通的孔隙及粗糙的侧壁。 ⅡI 万方数据 中文摘要 中文摘要 而且，与传统GelMA支架相比较Bio．GelMA支架材料少了一层薄薄的表皮(上 下底面)， 【结论】 我们利用热致相分离技术(TIPS)合成了物理结构和化学组成类似于天然 骨ECM的支架。 第二章仿生明胶甲基丙烯酰胺水凝胶支架复合ADSCs的体外成骨 研究 【目的】 研究仿生明胶甲基丙烯酰胺水凝胶支架与ADSCs共培养并诱导成骨分化的 情况。观察ADSCs种植于材料后的不同时间点生物相容性、碱性磷酸酶活性、 钙盐沉积量、基因表达水平的变化趋势等评价指标。 【方法】 ADSCs细胞种植于材料，成骨诱导第7，14，21天后评价其活力。激发／发射 滤片设定为488／530衄观察活细胞(绿色)，设定为530／580 ilrll观察死细胞(红 色)。每个时间点选取6个样本，使用Image J软件计算活细胞和死细胞的数量。 把ADSCs分为两组，分别种植于材料或种植于培养皿中，并加入成骨诱导 培养基培养。第7，14和21天后，首先用PBS洗涤各组样品三次；随后，将种植 于60mm细胞培养皿中的ADSCs于冰上加入Lysis Buffer裂解，而种植于材料上的 ADSCs直接加入Lysis Buffer后用匀浆器研磨。按照说明书步骤(碱性磷酸酶检 测试剂盒)使用酶标仪，在405rim处测试吸光度。 茜素红染色(ARS)能够定性定量评价分析成骨细胞的钙盐沉积。ADSCs 种植于材料或者种植于培养皿中并用成骨诱导培养基培养。第7，14和21天后， 样品首先依次用PBS洗涤三次，4％多聚甲醛固定1小时；然后D．PBS洗涤2次，室 温下0．1％ARS染色15分钟；随后，用D．PBS洗去ARS，在倒置显微镜下观察照 IV 万方数据 硕士学位论文 硕士学位论文 片。为了定量分析钙盐沉积，样品再次加入100mM氯化十六烷基吡啶反应30分 钟。收集染色液，使用酶标仪在562nm钡lJ吸光度。 我们通过RT-PCR来评价重要的骨相关的基因表达水平：使用RNA提取试剂 盒分离和纯化总RNA。使用第一链cDNA合成试剂盒，加入逆转录酶使ImgRNA 合成第一链cDNA。样品一式三份，使用ABI StepOne Plus系统进行RT-PCR。 【结果】 我们观察到材料内有许多ADSCs，且ADSCs在材料表面长势良好。随着时 间的推移，ADSCs与支架材料联系越来越紧密，并且，ADSCs牢牢地附着在材 料的孔洞骨架上，并可以沿着材料的侧壁走形成列生长。 第14和21天的ALP活性定量分析结果提示材料上种植的细胞的ALP活性 明显比对照组的高Qo．oi)，而第7天结果无统计学差异。此外，21天较14天 的ALP量增加了近一倍。而且随着时间的推移，材料上种植的ADSCs的ALP 活性逐渐增加，但对照组则降低。 随着时间的推移，材料上种植的ADSCs组较无材料种植ADSCs组(对照组) 钙盐沉