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蛋白鉴定分析 2.3质谱法 2.3.1原理： 质谱仪是利用电磁学的原理，使带电的样品离子按质荷比进行分离的装置。离子电离后经过加速进入磁场中。其动能与加速电压及电荷Z有关。 Z：电荷数 ZeU=mv2/2 e：电荷(e = 1.60x10-19C) U：加速电压 m：离子的质量 v：离子被加速后的运动速度 具有速度v的带电离子进入质谱仪的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终实现各种离子按m/z进行分离。 根据质量分析器的工作原理，可将质谱仪分为动态和静态仪器两大类，静态仪器采用稳定的电磁场，按空间位置来区别m/z不同的离子。动态仪器采用变化的电磁场，按时间不同来区分m/z不同 的离子。 分离生物大分子多采用电喷质谱法，属于动态质谱仪。基本原理是生物大分子在很高的电场下电离。样品溶液以很低的流速，在高的電場下使生物分子从毛細管中流出來。 2.3.2方法： 样品溶液以很低的流速(1-20μl/分钟)从毛细管中流出来。在毛细管的柱头上施加一个高电压(1-5kv)，是柱头液体雾化成很细的带电液滴，这种带电液滴在逆向干燥气流中挥发，使液滴表面电荷密度增大。直到产生的库仑斥与液滴表面张力的雷利极限值相等时，液滴就会发生爆裂，形成更小的子液滴，这些子液滴又被蒸发，又会形成爆裂。如此循环下去，直到液滴变得非常小，它的表面的电荷密度变得非常大，形成很强的电场，并从液滴中解离出带多电荷的分子离子。这些离子是靠吸附上或丢失若干质子而形成的，所以正离子或负离子谱上会观察到谱峰。生物大分子在ESI谱上往往是一组带不同的电荷的分子离子峰。 2.3.3结果 2.4核磁共振波谱 核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR).是将具有磁矩的核放入磁场后，用适宜的频率的电磁波照射，它们就会吸收能量，发生原子核能级的跃迁，同时产生核磁共振信号，得到核磁共振波谱。在有机化合物中，经常用于1H和13C核的共振吸收波谱。在生物学方面主要研究生物大分子的结构和分子量。到目前为止，采用1H 2D-NMR（二维NMR）能解决的最大蛋白质分子量在10000Da左右。如果采用杂核多维NMR技术，能解决的最大蛋白质分子量大在25000Da左右。 6几种测定蛋白质分子量方法的比较 方法 机理 分子量计算 关键技术 特点 电泳 分子表面电荷 电泳条带(mR) SDS包裹 单链分子 层析 分子质量 层析峰的位置 介质交联度 球形分子 质谱 质荷比 质谱峰直接标识 样品质子化 整体分子 核磁 核磁共振波谱 核磁谱线计算 磁场能量 整体分子 3蛋白质的等电点测定技术 3.1等电聚焦电泳(Isoelectrofocusing，简写IEF) 3.1.1原理 通常是指聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳。它是60年代初建立起来的一种蛋白质分离手段，现在已经成为单向蛋白质电泳分辨率最高的一种分离技术，其分辨率可以达到0.01个pH值，有的文献报道可以达到0.001个pH值。它是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点的差异进行电泳分离和分析。蛋白质在一个稳定的线性pH梯度的凝胶中电泳，蛋白质朝着与自身电荷相反的方向移动，在移动的过程中不断被凝胶中的反离子中和，最后静电荷完全被中和而停止运动，聚焦在等电点的位置。 * 蛋白质性质鉴定 ? 1 蛋白质分子量测定 DSD-聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶排阻层析 电喷质谱 核磁共振 2 蛋白质等电点的测定 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳 PBE-Sepharose聚焦层析 1概述 1.1什么是蛋白质性质鉴定 蛋白质分析鉴定是蛋白质研究中的一个最基本技术,是确定蛋白质产品的是与非的问题,尤其是在研究新的蛋白质组分时显得更重要。研究一个新的蛋白质首先要从它的基本性质作为突破口，然后根据它的基本性质进行分离纯化，最终用纯品对其进行分析鉴定。如果对蛋白质的基本性质尚未搞清楚，工作起来将会困难重重。因此，蛋白质研究技术主要是对蛋白质的基本性质的进行分析鉴定。 1.2蛋白质鉴定的主要参数 蛋白质分子是非常复杂的生物大分子,能代表其特征参数很多.但在普通实验室能够进行测定的、最常用的参数，归纳起来主要有以下几种。 (1)蛋白质的质量鉴定(分子量) (2)蛋白质带电性鉴定（等电点） (3)蛋白质结构鉴定(一、二级结构、晶体结构、肽谱、N和C-末端) (4)蛋白质生物学功能鉴定(生物活性、比活、酶促动力学) (5)免疫学