菠萝蛋白酶的制备试验原理-黑龙江生物科技职业学院.ppt

实训五、菠萝蛋白酶的制备 目的要求 原理 材料用具 操作方法 操作方法 操作方法 操作方法 操作方法 思考 题 * 黑龙江生物科技职业学院 生物制药技术 生物分离技术 主讲人：张爱华 实验原理 2 材料用具 3 操作方法 4 目的要求 2 1 5 5 注意事项 了解单宁沉析法提取菠萝蛋白酶的原理 掌握提取菠萝蛋白酶的基本操作技术 菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白酶 ，稍溶于水，不溶 于乙醇、丙酮、氯仿、乙醚，最适pH值为7，微有 异臭，其酶活力能被半胱氨酸激活，而受重金属 抑制 用单宁沉析法提取鲜菠萝中的菠萝蛋白酶，用乙二 胺四乙酸螯合原料中重金属离子 ，抗坏血酸则可使 酶活性中心保持还原状态 ，锌离子、硫代酸钠、 L-半胱氨酸对酶有激活作用 鲜菠萝（1500g左右） 0.5％、0.1％EDTA-Na（二乙胺四乙酸钠） 0.5％乙酸锌溶液 0.06％、0.1％抗坏血酸溶液 1％单宁（别名鞣酸） 1.5％氯化钠溶液 0.5％硫代硫酸钠溶液； 1％L-半胱氨酸溶液。其配制方法是：①称取L- 半胱氨酸0.1g，加水10ml，加1mol／L盐酸溶液 6～8滴使之溶解；②用6mol／L的氢氧化钠溶液 中和至pH3～4。 鲜菠萝 1500g 取1000g 菠萝汁 去刺、洗净，用压榨机压汁液 5％ 苯 甲 酸 钠 溶 液 10ml 离心机 3000r/min 20 min 板框压滤机 澄清 菠萝汁 1.榨汁除杂质 2.加稳定剂单宁沉析 澄清 菠萝汁 加入0.5％EDTA-Na 80ml 0.1％的抗坏血酸溶液60ml 搪瓷桶 移入 4℃下 静置 1h 立 刻 加 1％ 单 宁 100ml 离心机 3000r/min 15 min 沉析物 收集 3.洗脱 沉淀物 加0.5％乙酸锌溶液20 ml 搅拌 静置 10min 加 0.06％ 抗 坏 血 酸 30ml 搅拌 静置 5min 加 1.5％ 氯 化 钠 20 ml 搅拌 静置 10min 加 0.5％ EDTA 溶液 20ml 静5min 离心 3500r/min 10 min 取沉淀 4.激活 沉淀物 加0.5％硫代硫酸钠20 ml 搅拌 静置 10min 1％ L- 半 胱 氨 酸 10ml 搅拌 静置 5min 离心 3500r/min 10 min 菠萝 蛋白 酶沉 淀 5.冷冻干燥 解冻 离心 3000r/min 10 min 菠萝 蛋白 酶沉 淀 -15℃冷冻 10～15h 氯化钙 五氧化二磷 干燥5～10h 研磨 成粉 2～10℃ 保存 注意事项 1.选取70％～80％成熟的新鲜菠萝 2.避免热、酸、碱、重金属盐、紫外线的影响 4.常用pH试纸检测pH值的变化 3.整个操作中注意温度的变化 1．洗脱时如果不加入氯化钠溶液应如何继续 分离纯化菠萝蛋白酶？ 2．如何提高菠萝蛋白酶收率和酶的活力？ *