甘蓝型油菜每角粒数主效qtl qs发s.c9的克隆和功能研究.docx

华中农业大学2015届博士研究生学位(毕业)论文1．4．3 华中农业大学2015届博士研究生学位(毕业)论文 1．4．3 ESTl／SMG5—7蛋白质在胚胎发育r11的作用 18 1．4．4 ESTl／SMG5—7蛋白质在拟南芥中的研究进展 19 1．4．4．1 AtSMG7在NMD途径中的作用 20 1．4．4．2 AtSMG7在减数分裂中的作用 21 2本研究的目的与意义 ．22 3材料和方法 ．23 3．1试验材料 23 3．2材料的种植和管理 ．．24 3-3技术路线 ．．24 3．4 qSS．C9近等基因系的构建 ．．25 3．4．1 DNA的提取 25 3．4．2前景选择和背景选择 25 3．4．3性状考察 25 3．5分子标记的开发和分析 ．．25 3．5．1 Bulk池的构建 25 3．5．2AFLP标记的开发及SCAR标记的转化 ．26 3．5．3 SSR标记的开发和分析 26 3．5．4基于比较测序SCAR标记的开发和分析 26 3．6 qSS．C9局部遗传连锁图的构建和遗传效应分析 ．．26 3，7 qSS．C9高世代遗传分析 一27 3．8 qSS．C9的精细定位 一27 3．8．1群体的种植 27 3．8．2标记分析 27 3．8．3交换单株表型考察及后代验证 27 3．9 BAC文库的筛选及候选BAC克隆的测序 27 3．9．1 BAC文库 27 3．9．2 BAC文库的提取和筛选 28 3．9．3亚BAC克隆的筛选和测序 ．．28 3．10候选基因预测及比较基因组学分析 28 万方数据 甘蓝型油菜每角粒数主效QTL 甘蓝型油菜每角粒数主效QTL qSS．C9的克隆和功能研究 3．11农杆菌介导的遗传转化 28 3．1 1．1载体与菌株 ．28 3．11．2转基因受体材料 ．29 3．11．3载体的构建 ．29 3．11．3．1功能互补验证载体的构建 29 3．11．3．2 RNAi载体的构建 31 3．11．3．3启动子表达载体的构建 32 3．11．3．4亚细胞定位载体的构建 33 3．1 1．3．4．1油菜总RNA的提取及逆转录 ．．33 3．11．3．4．3载体构建 37 3．11．4甘蓝型油菜的遗传转化 ．38 3．11．5拟南芥的遗传转化 ．38 3．12转基因植株的检测 38 3．12．1转基因植株的DNA水平检测 38 3．12．2转基因植株的RNA水平检测 38 3．12．2．i转基因植株的RT-PCR检测 38 3．12_2．2转基因植株的qPCR检测 39 3．12．3转基因植株的表型考察及后代验证 ．39 3．13 NIL(HZ396)和NIL(Y106)胚珠发育过程观察 39 3．13．1子房整体透明法 ．39 3．13．2石蜡切片法 ．39 3．13．3胚珠激光共聚焦显微镜观察 ．41 3．13．4大孢子母细胞胼胝质染色 ．4l 3．14 qSS．C9及其同源基因的表达分析 42 3．14．1 RT-PCR分析 42 3．14．2 GUS染色分析 42 3．15亚细胞定位实验 42 3．16 RNA测序和分析 42 3．17腼弼7的进化分析 ．42 万方数据 华中农业大学2015届博士研究生学位(毕业)论文4结果与分析 华中农业大学2015届博士研究生学位(毕业)论文 4结果与分析 ．44 4．1 qSS．C9位点近等基因系的构建 ．．44 4．1．1 BClFl群体的标记分析 ．44 4．1．2 BC2F1群体的标记分析 ．45 4．1．3 BC3Fl群体的标记分析和性状考察 ．45 4．1．4 qSS．C9位点高世代遗传效应分析 46 4．1．4．1 BC3F2世代的性状考察 一46 4．1．4．2 qSS．C9位点的标记开发和局部遗传连锁图的构建 ．47 4．1．4-3 BC3F2群体中qSS．C9位点的遗传效应分析 ．5l 4．2 qSS．C9的精细定位 ．．52 4．2．1定位群体的分析 ．52 4．2．2新标记的开发和交换单株检测 55 4．2．3 BAC重叠群的构建 56 4．3 qSS．C9的克隆 ．．57 4．3．1候选基因的预测 57 4．3．2候选基因的比较测序 58 4．3．3候选基因的转基因验证 58 4．3．3．1候选基因转基因验证载体的构建 ．58 4．3．3．2候选基因的功能互补验证 ．59 4．3．3．3候选基因的RNAi验证 ．．61 4．4 BnaC9．SMG7b和BnaC9．SMG7c的序列分析 63 4．5 BnaC9．．S煳76的进化分析 ．65 4．5．1高等植物跚佑7同源基因的进化分析 66 4．5．2十字花科SMG7同源基因的进化分析 68 4．5-3芸薹属SMG7