改性聚n-异丙基丙烯酰胺协助蛋白质体外复就性分析.docxVIP

浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 摘要 摘要 蛋白质体外重折叠复性技术已成为目前基因工程蛋白质产业化的瓶颈问题。 开发新型、高效，同时又易于操作和回收的蛋白质体外复性添加剂成为近年来的 研究热点之一，其中聚N．异丙基丙烯酰胺(肿叮PAM)作为一种温敏型聚合物受 到了研究者的极大关注。本文以温敏型PNIPAM类聚合物作为研究对象，采用 共聚、表面接枝以及特定功能基团引入等方法对聚合物进行了改性，并对改性后 PNIPAM聚合物协助蛋白质体外复性过程进行了研究。 采用反相悬浮法合成一系列具有不同丙烯酸钠含量的粒状共聚凝胶 P(NIPAM．CO．SA)，对凝胶粒子的形态以及温敏性能进行了研究。将共聚凝胶用 于亲水性较强的溶菌酶体外复性，考察了各种复性条件对于溶菌酶复性过程的影 响。当蛋白浓度为250 gg／ml时，P(NIPAM．CO—SA)(√懈％)的加入可以使复性 收率从稀释复性的55．6％增加到76．5％。共聚凝胶重复利用5次后溶菌酶的活力 回收率仍有61．5％。通过对复性蛋白的结构进行分析，确定共聚凝胶通过有效抑 制复性过程中聚集体的生成提高复性收率。 采用无皂乳液聚合法和光引发法合成了接枝有PNIPAM毛发的聚苯乙烯微 球(PS．grafted．PNIPAM)，研究了微球的形态和温敏性能。考察了具有不同核，t5 大小和毛发长度的PS．grafted．PNIPAM微球协助模型蛋白溶菌酶和重组人Y．干扰 素(rhIFN-丫)包涵体体外复性的效果，优化了加胶量、温度、尿素浓度等复性 条件。实验结果表明，PS．grafted．PNIPAM微球可以大幅提高溶菌酶和rhIFN-，、／ 的复性收率。 采用RAFT方法合成了三种具有不同巯基负载量的PS．grafted．PNIPAM微球。 以溶菌酶为模型蛋白考察了巯基改性PS．grafted—PNIPAM微球在不同氧化型谷胱 甘肽(GSSG)浓度下协助复性的效果，为后续研究提供基础数据。 改性PNIPAM微球通过与变性蛋白的疏水相互作用协助目标蛋白质进行体 外重折叠复性，具有良好的协助蛋白质体外复性效果，同时PNIPAM的温敏性 有助于蛋白质复性后与微球分离，可将微球回收重复利用，是一种新型高效的复 性添加剂，具有广阔的应用前景。 关键词：聚N．异丙基丙烯酰胺；温敏型聚合物；共聚；表面接枝；巯基改性； 包涵体；体外复性；溶菌酶；重组人丫．干扰素 111 浙江大学硕士学位论文Abstract 浙江大学硕士学位论文 Abstract How to refold proteins expressed as inclusion bodies into correct conformation witll 11igh yield at hi．gh concentration is becoming one of the industrial bottlenecks in biological engineering field．In order to solve above problems，novel refolding technologies have been explored recently,and poly(N—isopropylacrylamide) (PNIPAM)hydrogel attracts much attention due to its thermo—sensitive characteristics． In this thesis，copolymerized and grafted PNIPAM were synthesized and then applied into refolding of lysozyme and recombinant human interferon-y(rhIFN-7)in vitro． Firstly,P(NIPAM··CO--SA)gel particles were synthesized using inverse suspension polymerization by adding sodium acrylate(SA)to improve the phase transition properties of PNIPAM．The morphologies，size distribution and thermo—sensitive characteri