细胞培养技术 教学课件 ppt 作者 兰容 周珍辉 主编 章静波 主审 实验部分7动物细胞的传代培养.pptVIP

细胞培养技术 教学课件 ppt 作者 兰容 周珍辉 主编 章静波 主审 实验部分7动物细胞的传代培养.ppt

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实验七 动物细胞的传代培养 一、实验目的 掌握动物细胞培养传代的基本方法和操作过程。 二、实验原理 当原代培养细胞或细胞系细胞增殖达到一定密度后(一般形成致密单层),则需要做再培养,即将培养的细胞分散后,以适当比率转移到另一个或几个容器中扩大培养,此过程为传代培养。一般将传代培养的累积次数作为传代细胞的代数。 三、器材 超净工作台 二氧化碳培养箱 普通显微镜 倒置显微镜 酒精灯 吸管 四、试剂和材料 Hanks液 75%酒精 0.25%胰蛋白酶 DMEM培养液 (含小牛血清及青、链霉素) 五、操作 1、吸去或倾出旧的细胞培养液(对于小口的培养瓶可采用倾倒方法,对于培养皿,必须用吸管吸出)。 2、吸取适量的Hanks液加入培养瓶中,轻轻振荡后弃去,重复一次,以清除血清成分,利于胰酶消化。 3、加入适量0.25%胰蛋白酶(一般0.1~0.2mL/cm2,以消化液能覆盖整个瓶底为准)转动培养瓶,使其湿润整个细胞层,37℃下消化2-3分钟。翻转培养瓶,肉眼观察细胞单层,见细胞单层薄膜出现针孔大小空隙时即可吸除消化液(细胞的解离程度也可以通过倒置显微镜直接观察判断,一般以细胞突起缩回,细胞之间间隙增大,细胞缩成圆形等为准)。如消化程度不够,可延长消化时间;如见大量细胞片状脱落,表明已消化过头,则不能吸除消化液而直接进行下一步操作。 4、加入适量培养液终止消化 5、吸取瓶中培养液反复吹打瓶皿底壁上的细胞层,至全部冲下,轻轻吹打,混匀,成细胞悬液,取样计数,调整细胞密度为5×104 /ml。15cm培养瓶培养时,吸取1ml细胞悬液加到新培养瓶中,加入4ml培养液,盖好,置37℃孵箱中培养。 6、观察:细胞传代后,应每日对细胞进行观察,注意是否污染及细胞贴壁和生长情况。 六、注意事项 1、吹打过程需有序进行,即从一边开始到另一边结束,注意边角处。 2、吹打时动作不宜过猛。 七、结果与讨论 1.利用倒置显微镜,绘制出传代细胞生长图。 2.讨论影响本次实验能否成功的主要因素 * * 培养瓶 烧杯 离心管 离心机 镊子(圆头) 血球记数板

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