五年制融合试验遗传学部分.doc

凋亡细胞的诱导及检测 一、实验目的 掌握培养细胞诱导凋亡的方法 掌握凋亡细胞形态特征检测方法 掌握基因组DNA特征及凋亡相关蛋白的检测方法 熟悉PCR原理及技术 熟悉凋亡相关知识、科研的基本思路 二、实验内容 1、培养细胞凋亡的诱导、凋亡细胞形态学、细胞增殖活力检查 2、凋亡细胞的DNA ladder、caspase3活性检测 3、培养细胞RNA的提取及定量、逆转录PCR 4、PCR法扩增凋亡相关基因Bcl-2和Bax、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 三、实验步骤与操作 第一天（8学时） 理论知识讲解：凋亡诱导方法及诱导药物剂量计算（细胞加药后诱导期间讲解） 实验内容及安排： 1、培养细胞的凋亡诱导（实验教材p137，p144）约需2h 2、倒置相差显微镜下观察凋亡细胞的形态变化（实验教材p145） 3、培养细胞的Giemsa染色、吖啶橙荧光染色、碘化丙啶（PI）/Ho.33342荧光双染检测（实验教材p146-148） 4、MTT法检测细胞内琥珀酸脱氢酶活性及细胞存活率计算方法（实验教材p137） 操作步骤： 1） 凋亡诱导：用25ml培养瓶体外培养人肿瘤细胞株（BEL-7402细胞或HepG2），2～3d传一代。 a) 实验前一天将细胞以2ⅹ104/ml接种于预先放入盖玻片的24孔板中。在试验前2～4 h加入凋亡诱导剂大蒜素（60 mg/L），37℃、5%CO2、饱和湿度条件下继续培养，用于细胞形态观察。 b) 实验前一天将细胞以每孔5×104密度接种于96孔板中，在对数生长期进行分组实验：设空白组、正常对照组、大蒜素诱导组（空白组未加任何处理、正常对照组加PBS），用于MTT法测定细胞内琥珀酸脱氢酶活性。 2）凋亡细胞形态观察：体外培养的正常肝癌BEL-7402细胞为上皮形细胞，多边形，胞体丰满，核大而明显，可见多个核仁，细胞之间边界清晰，折光性好。60 mg/L大蒜素作用2～4 h，BEL-7402细胞出现典型的细胞凋亡形态变化：细胞体积缩小，染色质浓聚边集、裂解，细胞表面凸起多个小泡。后期凋亡细胞胞体消失，残留不规则的细胞碎片。 3）Geimsa染色： a）细胞固定：取出盖玻片，PBS轻轻漂洗2次，充分干燥。甲醇固定5～10 min，空气干燥。 b） 上述固定后的细胞用Geimsa工作液染色10～20 min，流水冲洗后充分干燥，二甲苯透明2 min，中性树胶封片。 c） Geimsa染色结果观察：高倍镜下观察。正常培养细胞核染成蓝紫色或紫红色，圆形或椭圆形，细胞质淡染，边界不明显。凋亡细胞核内发生边集的染色质呈深紫色。胞体周围凋亡小体着色深浅不一，深染者提示含有染色质断片。晚期的凋亡小体碎片不规则，淡染。 4）吖啶橙荧光染色： a）取出盖玻片，PBS轻轻漂洗2次，95%乙醇固定10 min后充分干燥。滴加0.01% 吖啶橙染液染5 min，盖玻片临时封固后观察荧光。 b）吖啶橙染色结果观察：荧光显微镜下(选用紫蓝光激发滤片)观察。正常培养细胞核发黄绿色荧光，细胞质发桔红色荧光。凋亡细胞核内边集的染色质呈深黄绿色，胞体周围含有染色质断片的凋亡小体呈黄绿色，无染色质断片的凋亡小体呈橘红色。 5）碘化丙啶（PI）/Ho.33342荧光双染检测 a）取出24孔培养板中的飞片置于载玻片上 ｂ)0.01M的PBS轻轻洗细胞3次，平均每次5min。 c)加入荧光探针PI/Ho.33342。PI使用浓度为50ug/ml，Ho.33342使用浓度为10ug/ml，37℃温箱中标记20-30min d)0.01M的PBS轻轻洗细胞3次，平均每次5min。 e)封片：封片剂为90%的甘油(90％甘油+10％ 0.1M的PBS）。 f)荧光显微镜下观察：在紫外光激发下，正常细胞和凋亡细胞都发出明亮的蓝色荧光，坏死细胞发桔红色荧光。正常肝癌细胞核荧光均匀，而凋亡细胞核凝集的染色质发强蓝色荧光，周围可见带蓝色荧光的凋亡小体。 6）MTT法检测细胞内琥珀酸脱氢酶活性：对上述接种于96孔板的细胞在药物作用终止前4小时，于各孔加入5mg/ml的 MTT 20μl，细胞放回培养箱继续培养4小时后终止培养。小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入100μl DMSO，振荡10～20分钟，使结晶物充分融解。使用酶标仪测定各孔光密度值，测试波长570 nm。各组OD值取均值后，计算存活细胞百分数。 第二天（8学时） 理论知识讲解：凋亡信号转导途径（电泳期间讲解）；caspase3酶活性测定原理 实验内容及安排： 1、培养细胞RNA提取（实验教材p156） 2、低电压电泳 3、培养细胞裂解液制备（增加内容） 4、caspase3酶活性测定（增加内容） 操作步骤： DNA ladder分析： 1） 细胞收集：上述用25ml培养瓶体外培养的细胞经凋亡诱导剂诱导后（2