RNA提取注意事项.doc

1、将研钵，研杵，试剂瓶，容量瓶（配溶液用），三角瓶（溶胶用），药匙，玻璃棒等，用锡箔纸包住在烘箱中高温烘烤（180℃ 8hr，或200℃ 4hr）。2、 配0.1％ DEPC-H2O：将DEPC母液按比例（H2O：DEPC＝1000：1）溶于双蒸水中，在37℃摇床上摇荡过夜，注意避免光照。DEPC-H2O主要作两种用途，一则用于处理试验中所用的器具，如不能高温烘烤的离心管等，除RNA酶，作此用途时不能高压灭菌，一则是用于配制提取过程中所用的溶液，如5M Nacl溶液，75%酒精等，配制前先要高压灭菌。故配制时或一次配两份，或配后用高温烘烤过的试剂瓶分装。注意：DEPC是挥发性有毒试剂，且见光分解，配制时注意防护，最好单独灭菌，配后避光保存。3、 定购无RNase的专用枪头和Eppendorf管。否则，要用DEPC水处理并且摇荡过夜，然后高压灭菌。4、用DEPC水配制Nacl溶液，75%酒精，及MOPS缓冲液等；氯仿、异丙醇，无水乙醇等用新开封的试剂，最好用烘烤过的试剂瓶分装。⑤ 将电泳槽，制胶槽、梳子用0.1mol/L NaOH洗涤浸泡10-20min，然后用DEPC-H2O冲洗干净，再用75%的酒精擦拭干，备用。⑥ 准备消毒的厚手套一双，乳胶手套若干双。 为什么我在用RNA试剂盒提取植物总RNA时没有结果？请大家帮忙分析一下！ RNA 被降解了。1、新鲜细胞或组织：影响因素：裂解液的质量、外源RNase的污染、裂解液的用量不足、组织裂解不充分，另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏，胸腺等)，很难避免 RNA 的降解。解决方案：建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。2、冷冻样品：解决方案：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，研磨过程中及时补充液氮。3、环境中RNase的清除：（1）DEPC处理各种实验器具（2）RNAsase对溶液中RNase进行清除。（3）RNA酶喷雾清除剂，可对固体表面的RNase起到清除的作用，更大程度上避免RNase的污染。4、采集样品的保护：通常用液氮保存；也可使用样品保护剂RNAfixer,样品浸泡其中可以在37℃保存一天，25℃一周，4℃一个月，-20℃一年左右。 RNA的提取是要非常注意的，一不小心就会导致RNA的降解。（１）玻璃制品、塑料制品和电泳槽 灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶法染，使用前必须于180 ℃干烤８小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。另一种方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂，但其作用并不是绝对的（Ｆedorcsak和Ehrenberg,1966）。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置２小时，然后用灭菌水淋洗数次， 并于100℃干烤15分钟（Ｋumar和Ｌindberg,1972)。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸氯灭菌15分钟。上述处理可以除去器甲上痕量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。　　羧甲基化的RNA在无细胞体系中翻译效率很低，然而，除非其中大部分嘌呤碱基均被修饰，否则其形成DＮＡ：RNA或RNA：RNA杂交休的能力并不明显降低。用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满３％的Ｈ２Ｏ２溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1 ％DEPC（见下文）处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为RNA实验专用。（２）研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此，在准备分离的和分析RNA的材料和溶液时，主有涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套，接触“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此进行RNA实验时应勤换手套。（３）污染的溶液 用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应用0.1％DEPC于37℃至少处理12小时，然后于100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15分钟。注：DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因些不能用来处理含有Ｔris 一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Ｔris晶体以制备无RNA酶的溶液。