大肠菌类之检测.ppt

大腸菌類之檢測 多管發酵法 大腸菌類定義: 革蘭式陰性、好氧或兼氧、無芽胞桿菌，能於35oC、48小時分解乳糖產生酸及氣體。可分糞便性及非糞便性。 以大腸菌類為污染指標原因: 1. 存於溫血動物消化道，對人或動物無害； 2. 比其它致病菌生存能力強，因此如無大腸菌，可確定無致病菌； 3. 在環境中只會遞減，所以可由其數量推估污染時間； 4. 僅需少量水樣即可進行實驗。 大腸菌類之測定法: 多管發酵法(multiple-tube fermentation method): 是以統計方法推導，求出單位體積菌液內大腸菌類數目之最大或然值(most probable number, MPN)。以MPN/100mL表示之。 水樣經10、100、1000倍稀釋，再以3或5根試管進行。由其產氣管數，查表而得。 多管發酵法之檢驗可分: 推定試驗(presumptive test)、確定試驗(confirmed test)、完成試驗(completed test) 。 多管發酵法檢驗之三大步驟: 推定試驗 確定試驗 完成試驗 目的 檢驗是否有使乳糖發酵之大腸菌類 確認前法有產氣者 確認前試驗有產氣者確實為大腸菌類 培養基 硫酸月桂酸胰化蛋白示培養基(lauryl sulfate tryptose broth, LST) 煌綠乳糖膽汁培養基(brilliant green lactose bile broth, BGLB) 伊紅甲烯藍培養基 (eosin methylene blue agar, EMB agar) 反應 使乳糖產生酸及氣體(以竇漢氏試管收集) 使乳糖產生酸及氣體(以竇漢氏試管收集) 在酸性環境下形成墨綠色金屬光澤之菌落 作用 有膽鹽作為表面張力抑制劑抑制大腸菌類以外之其它菌生長 煌綠和膽汁能抑制革蘭氏陽性及生成胞子之細菌生長 伊紅甲烯藍可抑制革蘭氏陽性菌之生長 對象 已知污染之水樣 推定試驗不合要求之水樣 水廠配水各處理階段之水樣 經氯處理之待放流水 浴用水 原水或配水之水質 1.每一試驗所使用之培養基內，會添加一些抑制劑，將某部份之菌篩選掉，因此皆屬於選擇性培養基。上一表格部份應熟記 ! 2.理論上應依環保署公告之方法(水中大腸桿菌群檢測方法－多管發酵法 NIEA E201. 54B ) 。 試劑 （一）試劑水：蒸餾水或去離子水，導電度在 25 ℃ 時小於 2 μmho / cm（μS / cm）。 （二）培養基，應使用市售商品化培養基。 1.硫酸月桂酸胰化蛋白腖培養基（Lauryl sulfate tryptose broth，簡稱 LST） 1倍濃度 LST 培養基含有下列成份： 胰化蛋白腖（Tryptose）　　　　　　　 20.0 g 乳糖（Lactose）　　　　　　　　　　 　5.0 g 氯化鈉（NaCl）　　　　　　　　　　　5.0 g 磷酸氫二鉀（K2HPO4）　　　　　　　2.75 g 磷酸二氫鉀（KH2PO4）　　　　　　　 2.75 g 硫酸月桂酸鈉（Sodium lauryl sulfate）　 0.1 g 試劑水????????????????????????????????? 1 L 　 步驟 （一）推定試驗 1.配成 2 倍濃度（取 71.2 g LST 培養基粉末溶於 1 L 試劑水），完全溶解後，分取 10 mL 注入裝有倒置發酵管(竇漢氏試管)之試管內，經 121 ℃ 滅菌 15 分鐘，冷卻後備用，滅菌後培養基之 pH 值應在 6.8 ± 0.2。滅菌後培養基若未當日使用，應保存在 4 ± 2 ℃，保存期限為 14 天。可根據檢驗需求量，依配方配製培養基。 慎選發酵管中沒有氣泡且未污染之 10 mL、 2 倍濃度 LST 試管。 2. 水樣在進行檢測或稀釋之前必須劇烈搖晃 25 次以上，以使樣品充分混搖均勻。 3. 視水樣中微生物可能濃度範圍進行水樣稀釋步驟，使用無菌吸管吸取 10 mL 水樣至 90 mL 無菌稀釋液中，形成 10 倍稀釋度水樣，混合均勻，而後自 10 倍稀釋度水樣以相同操作方式進行一系列適當之 100、1000、10000倍等稀釋水樣，進行稀釋步驟時，均需更換無菌稀釋吸管，水樣稀釋步驟如圖一所示（註 1）。 4. 以無菌吸管分別取各稀釋度 10 mL 水樣至內含 10 mL 2倍濃度的 LST 試管中，每一稀釋度各作 5 支，小心混合均勻，混合後發酵管內不可產生氣泡。(因實驗共有15根試管，每管10ml，共150 ml；但為了怕取樣差異，故培養液先取200 ml，並注意調整使用培養基之量) 5. 在 35 ± 1 ℃ 培養箱中培養 48 ± 3 小時，觀察並記錄發酵情形，若有氣體產生則推定試驗為陽性反應