哈尔滨医科大学第四期生物信息培训班-整合分析实验文档.pdf

哈尔滨医科大学第四期生物信息培训班 基于新一代测序技术的整合组学分析-实验文档 目标：分析RNA-seq 与MeDIP-seq 获取疾病相关的差异表达lncRNA 与异常DNA 甲基化区域，并识别受DNA 甲基化影响的lncRNA 。 使用软件：Tophat-2.0.8，Cufflinks，Bowtie-，Samtools-, Bedtools-2.6，R-3.0.0，MEDIPS-1.6.0，UCSC 使用平台：Linux 具体步骤如下： 准备阶段 1. 需要打开shell 软件 登入50 用户名：liyq 密码：bio_hrbmu 进入到特定的目录：cd /pub1/liyq/test/user 建立一个你自己的目录：mkdir xiaoyun 进入所建立的目录：cd xiaoyun 获得你建立目录的路径：pwd 一、识别疾病中差异表达lncRNA 1. 获取疾病与正常的RNA-seq 数据 疾病：/pub1/liyq/test/fasta/sc-RNA-seq-chr22.fa 正常：/pub1/liyq/test/fasta/nor-RNA-seq-chr22.fa 注意：这里的RNA-seq 数据都是来自22 号染色体 注意：由于多人同时比对与装配（尤其是tophat 比对），需要消耗大量的服务器 资源，建议学员只处理一个样本即可，或者直接拷贝已经比对与装配好的文件至 所建立的目录中 cp -R /pub1/liyq/test/user/xiaoyun/sc-RNA-seq.tophat ./ cp -R /pub1/liyq/test/user/xiaoyun/sc-RNA-seq.cufflinks/ ./ cp -R /pub1/liyq/test/user/xiaoyun/nor-RNA-seq.tophat/ ./ cp -R /pub1/liyq/test/user/xiaoyun/nor-RNA-seq.cufflinks/ ./ 2. 比对RNA-seq 数据 步骤简介：对RNA-seq 数据中的所有read 与参考基因组进行比对，并考虑剪切比对方式 步骤代码： 疾病： /pub1/liyq/test/sf/tophat -o /pub1/liyq/test/user/xiaoyun/sc-RNA-seq.tophat --bowtie1 --library-type fr-unstranded /pub1/liyq/test/sf/index/hg19 /pub1/liyq/test/fasta/sc-RNA-seq-chr22.fa 参数说明： /pub1/liyq/test/sf/tophat 表示mapping 软件tophat -o 表示结果的输出路径，即得到的结果存放在 /pub1/liyq/test/user/xiaoyun/sc-RNA-seq.tophat 这一目录下面(可以建立自己的结果文件 夹，但是注意要把你所建立的文件夹的权限设定为可写)； --bowtie1 表示使用的bowtie 的版本，这里使用bowtie1； --library-type fr-unstranded 表示测序时，文库制备的类型； /pub1/liyq/test/sf/index/hg19 表示mapping 过程中参考基因组的bowtie index，注意：这里 使用的是hg19 版本的bowtie index； /pub1/liyq/test/fasta/sc-RNA-seq-chr22.fa 表示需要进行mapping 的疾病RNA-seq 文件地址 由于该计算时间大约为10 分钟，并且多人同时计算，这里也为大家提供qsub 提交的脚本文 件(这种方式能够将处理需求移交到服务器其他的计算节点)，需要注意的是，你需要修改该 文件的部分内容，以便输出目录正确 /pub1/liyq/test/qsub/sc_RNA_seq_tophat.pbs #然后输入qsub sc_RNA_seq_tophat.pbs，就可以对疾病样本的RNA-seq 数据进行reads 的 mapping 注意：当你的结果输出文件夹中出现prep_ 等 ，则说明你的程序已经成功的运行， （这一过程比较久，大概需要10min）如下图所示： 注意：下图是最后得出的结果，tophat 这里给出以下几个结果，我们选择accepted_hits.bam 进 行转录本的装配 上述步骤仅是处理了疾病样本，你还需要对正常样本做同样的处理 nor-RNA