微小果核上人体脱落细胞的dna检验.docVIP

微小果核上人体脱落细胞DNA检验（1、补充中文摘要 ；2、作者联系方式；3、无引用文献） 李静，郑绍军，曾丽，赵彩云 （广安市公安局刑事科学技术研究所，四川 广安 638000） 【关键词】 法医物证学；微小果核物证；DNA检验；微量脱落细胞 【文章编号】 【中图分类号】DF795.4 【文献标识码】B 在现代犯罪行为中，现场物证呈现出多样化、微量化的发展趋势。在笔者接触的多起杀人、盗窃案件中，果核均成为案发现场提取的唯一生物检材。微量生物检材上粘附的脱落细胞数量有限，使得现场的PCR抑制因素更加突出，因此在提取微量生物检材上脱落细胞时应尽量多收集，至少达到足够一次PCR的细胞量。目前提取果核上脱落细胞常采用双棉签法或丝线擦拭法。该方法主要是针对体积较大的果核，对桔子、柚子核等微小果核提取效果较差。笔者结合一例入室抢劫杀人案介绍微小果核上人体脱落细胞DNA检验。 1 案例资料 2009年12月，四川某县江某（男，78岁）被杀死在自己家中。在死者家2楼及3楼堆放的油菜秆中提取桔子核及皮若干。实验室受理后，将剥下的桔子核种皮剪碎、浸泡、反复多倍纯水稀释、震荡、离心收集脱落细胞，采用chelex法联合QIAGEN试剂盒提取检验，获得完整DNA图谱。经比对分析，桔子核种皮上脱落细胞DNA分型与嫌疑人一致。 2 试剂及仪器设备 试剂：5%Chelex-100(5g 200-400目的Chelex-100 100ml超纯水)、PK10mg/ml、QIAGEN试剂盒、Sinofiler复合扩增试剂盒。 仪器：3130型基因分析仪、9700型PCR扩增仪。 3 检材情况 所送现场提取得桔子核共7粒，外表较干燥，不同程度粘附有柴草、灰尘、沙砾。 3.1 DNA提取 方法1：取2粒桔子核，用干棉签轻轻拭掉上面的灰尘、草屑，然后先用适度湿润的纱线用力擦拭果核表面一遍，再用干纱线再用力擦拭一遍。将两次擦拭纱线置于1.5mlEP管内，采用chelex法处理[1]，加入80ul chelex-100,并加入10mg/mlPK，使之终浓度达到200ug/ml,56℃消化60min以上，100℃煮沸8min；震荡后13000rpm离心5min， 方法2：取2粒桔子核，用干棉签轻轻拭掉上面的灰尘、草屑,剥除桔子核种皮，剪碎，置入1.5mlEP管内，纯水1000ul浸泡15min以上，期间吹打并高速震荡,13000r/min离心5min，去上清。再次加入纯水1000ul稀释高速震荡，13000rpm离心5min，重复该操作3-5次。采用chelex法处理，加入80ul chelex-100,并加入10mg/mlPK，使之终浓度达到200ug/ml,56℃消化60min以上，100℃煮沸8min；震荡后13000rpm离心5min， 方法3：取2粒桔子核，处理方法同方法2。取chelex法处理后的DNA上清液（全部吸尽，尽量不要吸到珠子），使用QIAGEN试剂盒中的PBI溶液按体积比5：1充分混匀，以13000rpm离心过柱子，弃掉下层液体，重复此操作直到混合液全部滤过，加已配无水乙醇的PE洗涤液500ul，离心洗涤1次，将65℃预热的EB洗脱液30ul直接加到纯化柱的硅膜上，13000rpm离心2min，4 3.2 PCR扩增与检测：分别取以上三种方法得到的模板DNA，采用10ul扩增反应体系，其中Reaction Mix 1.0ul,Gold Tag酶0.3ul，Primer set1.0ul,模板DNA 1.0ul、1.75ul、2.5ul梯度扩增,用超纯水补足体系。根据Sinofiler复合扩增试剂盒说明书设置，置于9700型PCR扩增仪扩增。 扩增产物经3130型基因分析仪电泳收集信息，用GeneMapperID v3.3进行等位基因分析。 3.3 结论:按照方法1处理桔子核未能得到STR基因座分型图谱，按照方法2处理桔子核未能得到全位点STR基因座分型图谱（图一），按照方法3处理桔子核检出全部STR基因座分型（图二）。 图一 图二 4 讨论 4.1 检材的收集:桔子核属于微小果核，果核上脱落细胞量较少，用棉签或纱线擦拭往往不能得到足够量的DNA模板，为此笔者采用将果核种皮剥离剪碎浸泡以收集足够量的脱落细胞，但因受果胶、果酸的影响，刚开始浸泡液十分粘稠，其比重大于细胞，故直接离心不能使脱落细胞沉淀，需要反复多倍纯水稀释震荡离心。这是收集脱落细胞的关键。 4.2 检材DNA提取:Chelex法提取微量生物检材上细胞DNA的优点是操作方便，步骤简单，整个提取过程在一个离心管中完成，减少了污染的机会，但是单用Chelex法提取缺点也十分明显，即不能浓缩纯化DNA，尤其对微量生物检材提取成功率低，如上述方法1、2，均未能得到满意的DNA STR分型