基因工程第6章 DNA重组的操作1.pptVIP

Review 第三部分 目的基因的分离 目的序列已知： 一般采用PCR技术或分子杂交技术分离克隆目的基因 目的序列未知： 差异表达序列 无差异表达的目的序列，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法、序列克隆法 一、目的基因的功能克隆 根据蛋白质的基本生化特性这一功能信息，在获知基因的功能后克隆 其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库，然后从文库中筛选目的基因 (1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因 (2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针，从cDNA表达文库中筛选相应克隆。 二、 序列克隆法 根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因 采用核酸探针杂交筛选或用PCR技术进行分离 三、差别杂交法 适用范围： 组织特异性表达或特定发育阶段表达的基因 受生长因子调节的基因 经特殊处理诱导表达的基因 基本过程 制备两种细胞群体的的mRNA提取物 以两种总mRNA或cDNA为探针 以表达目的基因的细胞群体构建cDNA文库 有目的基因表达的mRNA探针，重组体菌落阳性反应 目的基因不表达的mRNA探针，除目的基因之外，其余菌落都为阳性反应 比较底片，对照原板，可挑选出含选目的基因的菌落 四、减法杂交技术 又称差减杂交、扣除杂交、减数杂交、消减杂交 本质：尽量去除两种样品中普遍共同存在的基因序列，从而使目的基因序列得到有效的富集，从而提高基因筛选分离的敏感性 两种策略： mRNA减法杂交 基因组减法杂交 mRNA减法杂交 提取表达目的基因的细胞mRNA，反转录成cDNA 提取不表达目的基因的细胞mRNA 过量杂交 两种组织中均表达的基因产物形成cDNA/mRNA杂交分子 特异mRNA反转录的cDNA片段仍保持单链 五、mRNA差别显示技术 又称为差别显示反转录PCR（DDRT-PCR） 目的序列未知，1992年由美国哈佛大学医学分校Dena-Farber研究所的两位科学家Liang和Pardee首次提出的，并运用这种方法来分离一对培养的哺乳动物细胞中差别表达的基因。至今，运用mRNA差别显示技术分离、鉴定的差别表达基因大约有300多个。 3 ’端锚定引物 锚定引物的通式是oligo(dT)12MN，其中M为A、C、G中的任意一种，N为A、C、G或T中的任意一种，所以共有12种oligo(dT)12MN引物，用这12种引物分别对同一总RNA样品进行cDNA合成，即进行12次不同的反转录反应，每一种3 ’端锚定引物，都能够把总mRNA群体的1／12分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。 这样可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等但序列结构不同的12份亚群体。这一过程叫做差异显示反转录，即DDRT。 5’端随机引物 另外，还需要另外一种由10个核苷酸组成的5’端随机引物。 这种5 ’随机引物可以同特定细胞类型的总mRNA群体中的一部分分子发生杂交作用，而且杂交部位是随机地分布在距每条新合成的cDNA链3’端的不同位置上。 用3 ’端锚定引物和5 ’随机引物组成的引物对，以mRNA/cDNA为模板进行PCR扩增，然后经过2～3h的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以显示出在100～500bp之间的DNA条带 20种 5’端随机引物 12种 3’端锚定引物 240组引物，进行PCR PCR过程中加入放射性标记 变型聚丙烯酰氨凝胶电泳 放射自显影显示差异表达条带 对差异表达条带进行割胶回收并制备成探针，从文库中筛选 基本程序 提取两种细胞的总mRNA,反转录后成为2种cDNA 以一定的引物作随机聚合酶链反应 通过扩增产物的电泳分析,分离出不同样品间的差异条带 将差异DNA做成探针 在cDNA文库或基因组文库中筛选基因并作功能分析 2.1 重组质粒DNA转化大肠杆菌 转化（transformation） 定义 转化微生物的种类 感受态细胞 P139 转化过程 1.定义 转化：受体菌直接吸收供体菌的DNA片断而获得后者部分遗传性状的现象。 转化子（transformant）：通过转化方式而形成的杂种后代。 2.转化微生物的种类 首次发现转化现象 肺炎链球菌（Griffith,1928） 嗜血杆菌属、芽孢杆菌属、奈瑟氏球菌属、根瘤菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属等。 3. 感受态（competence） 感受态：指受体细胞最易接受外源DNA片断并能实现转化的一种生理状态。 感受态是细菌的一种遗传特性，而且也受生长阶段、培养条件的影响。 肺炎链球菌 对数生长后期 芽孢杆菌属 指数期末和稳定期 大肠杆菌 刚进入对数期 制备感受态细胞的注意事项 1. 细胞生长状态和密度: 不要