免疫荧光技术PPT课件.ppt

THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 荧光显微镜 光源：高压汞灯、氙灯、卤素灯 滤板：隔热滤板、激光滤板（UG、BG）、吸收滤板（OG、GG） 光路：透射光、落射光 a 透射光 b 落射光 第二节 荧光抗体的制备 1.免疫血清的制备　 制备高效价的特异性抗血清是免疫荧光技术成功的前提。通常以高效价的免疫血清为好，因为用这种血清制备荧光抗体，即使其中含有少量非特异抗体，也可以通过稀释法将其除去。 为提高血清效价，在制备免疫原时，通常采用大剂量加佐剂，长程免疫，其中以弗氏不完全佐剂最常用。即按抗原1份，无水羊毛脂1份，液体石蜡2份混合，待充分乳化后，免疫动物，即可能获得高效价的免疫血清。 ①搅拌法（直接标记法）　 取抗体球蛋白溶液10ml，碳酸盐缓冲液3ml，生理盐水17ml，混合，在4℃电磁搅拌下加FITC3mg（先溶解在3ml缓冲液中），在4℃继续搅拌4-6h，将结合物通过已平衡好的Sephadex G25柱，以除去未结合的游离荧光素。  2 荧光素标记 ② 透析标记法　 适用于小体积的标记。 将抗体球蛋白溶液用碳酸盐缓冲液（0.25mol/L，pH9.0调动1% (W/V )，并装入透析袋中，按蛋白质量的1/20称取FITC溶于10倍抗体溶液量的碳酸盐缓冲液中，将透析袋浸没于FITC液中，于4℃搅拌16-18h取出透析袋于0.01mol/L，pH7.2 PBS中透析4h，将结合物通过已平衡好的Sephadex G25柱，去除游离荧光素。 影响标记的主要因素　 温度:温度低，标记时间长，温度高，标记时间 应短。 时间:FITC0-4℃以6-12h为宜，20-25℃以1-2h为 宜，37℃30-45min为宜。 酸碱度:pH低时，标记较慢，pH值偏高（10）， 抗体易变性，pH值9.0-9.5最为适宜。 标记量:抗体蛋白含量低，标记慢，以每毫升含 20-25mg蛋白为宜。 3 免疫球蛋白的提纯 用于荧光素标记的免疫血清，需提纯后使用，这样不但可以提高抗体的效价，而且还可以排除γ球蛋白以外的蛋白质，减少非特异性荧光的出现。 从免疫血清中将特异性抗体提纯与荧光素标记是免疫荧光技术的关键一环。 在免疫荧光技术中所应用的特异性抗体， 主要是IgG类，其提纯方法很多，但以 饱和硫酸铵盐析法比较简便； 也可用分子筛层析法（即葡聚糖凝胶过滤）； 以及离子交换层析法等； 或先用盐析法精提，然后再经过层析柱进一步纯化。 标记抗体溶液  透析或凝胶过滤  DEAE-纤维素层析  抗原交叉吸收或组织制剂吸收 荧光抗体活性鉴定 （去除游离荧光色素） 粗制荧光抗体 （去除过度标记的蛋白分子） 精制荧光抗体 （去除特异交叉反应的标记抗体 ） 免疫纯荧光抗体 标记抗体的纯化　 F/P= 1.5(固体标本） 2.4(活细胞染色） 第三节 免疫荧光显微技术 免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。 免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。  一、标本的制作 1.涂片、印片、切片 2.标本的固定　通过固定，不仅使标记的抗体易于接近抗原，从而发生反应，而且要求标本中的抗原的活性不受损失，同时还要保护其自然形态和位置。 因此，根据所研究的抗原和组织细胞种类的不同，相应地采用不同的固定方法。应用最广泛的固定液是丙酮和乙醇，其次是甲醇、甲醛、丙烯醛等。切片标本大多用乙醇固定，组织培养标本主要用丙酮固定。 二、荧光抗体染色 1）? 直接法 1．标本经固定后，PBS洗涤3×3分钟。 2．加荧光素标记的抗体，湿盒内37℃孵育50 分钟。 3．PBS洗涤3×3分钟。 4．0.1％伊文氏兰复染。 5．PBS洗3次，蒸馏水洗2次，每次3分钟，以 除去NaCl结晶。 6．缓冲甘油封片，镜检。 直接染色法 优点是：特异性高，操作简便，比较快速。 缺点是：一种标记抗体只能检查一种抗原， 敏感性较差。 直接法应设阴、阳性标本对照，抑制试验对照。  2）? 间接法 1．标本固定后，PBS洗涤3×3分钟。 2．滴加一抗，37℃ 40分钟或4℃过夜。 3．PBS洗涤3×3分