第二十五章 克隆物培育技术.pptVIP

第二十五章 动物克隆技术 克隆动物(clonal animal)是指人们采用动物克隆技术得到无性繁殖的在遗传上与亲本动物完全相同的动物。 第一节 动物克隆技术的理论基础及发展简况 动物克隆技术的理论基础是动物细胞发育的全能性。 一、细胞发育的全能性 （一）全能性的概念 1、细胞的全能性 细胞分化能力的强弱称为发育潜能。 根据发育潜能可以将细胞分成全能性、多能性、单能性细胞及终末分化细胞。 受精卵以及胚胎干细胞的发育具有全能性；多能造血干细胞具有的发育潜能称为多能性 ；终末分化细胞，如人的成熟红细胞 。 细胞全能性的基础在于所有细胞的细胞核包含一个物种的全套染色体组，具有发育成一个完整个体所需要的全部遗传物质。 2、细胞核的全能性 细胞核的全能性是指一个细胞核具有该物种完整的遗传信息，在适当条件下能够发育成一个完整个体的能力。 将分化的细胞的细胞核导入去核的卵细胞或受精卵，发育成一个完整的个体（如体细胞克隆动物），就是细胞核全能性。 （二）证明细胞全能性的研究事例 1、动物早期胚胎细胞的全能性 2、已分化的动物细胞的全能性 1962年， Gurdon通过连续核移植，将爪蟾蝌蚪已经分化的肠上皮细胞核移植到去核的卵母细胞中，获得了可育的成熟个体。 1977年，Gurdon以一只白化爪蟾蝌蚪细胞为供体，克隆到了30只白化非洲爪蟾。 ⑵ 哺乳类的核移植实验 1981年，瑞士科学家Illmensee和美国科学家Hoppe首次报道哺乳动物细胞核移植获得成功。 ⑵ 哺乳类的核移植实验 1983年，McGrath和Solt结合显微技术与细胞融合技术，将单细胞期小鼠胚胎与未受精卵用病毒诱导融合的方法获得了后代 。 1996年，Campbell等采集9d龄的绵羊胚胎进行传代培养，以培养液中血清浓度递减的饥饿培养，诱导6-13代细胞进入静止期，移入去核的卵母细胞，产下了克隆羊。这是用已分化细胞系经诱导进入Go期核移植产下的首例克隆羊。 ⑵ 哺乳类的核移植实验 1997年，英国 Roslin研究所的Wilmut等用乳腺细胞核移植培育克隆绵羊——“多莉 (Dolly)”。Wilmut等采用6岁母羊（白面）怀孕3个月时的乳腺细胞进行核移植。供体核在血清浓度从10％降至0.5％的培养液中诱导至静止期，然后移入去核卵母细胞，发育为桑椹胚和囊胚再移植到受体母羊（黑面），结果产羔l头（白面） ，即著名的“多莉”。 体细胞核移植法培育克隆绵羊一多莉 二、供体核重新编程 早期使用原核期的受精卵和2细胞胚胎。1986年后采用去核的处在MⅡ期(第二次分裂中期)的成熟卵母细胞作胞质受体。 2、重构胚核质适应机理 Gurdon（1966）研究发现，核在移植前转录rRNA基因，移入卵后，核仁消失，rRNA基因失活；随着胚胎的发育，rRNA基因活性恢复，核仁重现。表明卵细胞质对核活性有重构效应。 事实上，核重编程同核质间蛋白质交换有关。许多细胞质因子，如组蛋白(去)、乙酰化酶、DNA甲基化/去甲基化酶等进入核内；核内转录因子，如异染色质蛋白、组蛋白H1等输出核外。 （2）核重编程 核重编程的过程就是基因重新被激活的过程。 体细胞去分化过程伴随着与染色质相关的蛋白(如连接组蛋白、转录因子)的重构、基因组甲基化变化、组蛋白组装及核小体形成等。染色质解聚对核重编程可能是必须的。 核重编程涉及到基因组DNA甲基/去甲基化和组蛋白乙酰化。通过基因组甲基化来改变DNA与蛋白质间的作用。 （3）端粒 在细胞分化过程中，核重编程须去除染色质上的获得性修饰。 牛成纤维细胞核克隆胚胎的端粒酶活性比胚胎干细胞样细胞的端粒酶活性显著降低；用血清饥饿法进行细胞传代，与不经处理的早期传代细胞相比，端粒酶活性降低30%-50%。 体外培养牛胎儿成纤维细胞和胚胎干细胞样细胞晚期传代中发现了端粒缩短。 3、细胞周期 细胞周期分四个时期，包括G1期，S期，G2期，M期。有丝分裂中，成熟促进因子（也叫M期促进因子MPF ）调控细胞由间期向M期转变。 核受体一般是MⅡ期卵母细胞，但是MⅡ期卵母细胞MPF的含量依然很高，将诱导移植核发生一系列的形态变化，包括核膜破裂(NEBD)，早熟染色体凝集(PCC)。只能将G1期(二倍体)的核移入未经活化的MⅡ期的卵母细胞的细胞质，才能获得染色体倍体正常且能正常发育的重组胚胎。 供体核重新编程的机理 具有全能性的细胞核是否具有重编程的能力，主要取决于细胞质启动供体核重新编程的因子。 核重编程涉及到基因组DNA甲基/去甲基化和组蛋白乙酰化。 在细胞分化过程中，核重编程须去除染色质上的获得性修饰。与端粒酶活性降低、端粒缩短有关 。 第二节 动物克隆技术方法 动物克隆技术方法可分为胚胎分割、胚胎嵌合、细胞核移植、雌核或雄核发育等。 细胞核移植方法又