分子生物学大实验li.ppt

材料： 转化植物（动物） 非转化植物（动物） 免疫前血清（负对照） 已知量外源基因表达蛋白制品（正对照） 实验方法： 仪器： 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳装置 电泳转移装置 试剂： SDS试剂:见电泳实验。 匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。 0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml。 膜染色液：考马斯亮兰 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。 包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。 显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺 0.1ml；H202 1.0μl。 一、蛋白质样品获得： 细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。二、电泳： 制备电泳凝胶，进行SDS。三、转移：（半干式转移） 1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。 2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。 操作步骤： 3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5h。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。 四、免疫反应：1、用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。2、加入包被液，平稳摇动，室温2h。3、弃包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。4、加入一抗（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），4℃ 放置12h以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。 5、弃一抗和1%BSA，用0.01M PBS分别洗膜，5min×4次。6、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释），平稳摇动，室温2hr。7、弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。8、加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。 1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。2、显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2。 注意事项： 小结： 一、植物（动物）蛋白提取 二、SDS电泳分离蛋白质 三、转移 四、封闭 五、免疫反应：1、第一抗体反应 2、第二抗体反应 六、酶反应显色 主要分子杂交方法比较 分子杂交 杂交水平 实验目的 探针 目标分子 实验原理 Southern DNA 证明外源基因整合到宿主染色体DNA上 DNA/RNA DNA 互补核酸分子之间的氢键特异性结合反应 Northern RNA 证明外源基因整合到宿主染色体DNA上，并正常转录 DNA/RNA RNA Western 蛋白质 证明外源基因整合到宿主染色体DNA上，正常转录并翻译出特异性蛋白质 特异性抗体 目标蛋白质 抗原-抗体免疫学反应  分子生物学是基因工程的理论基础 DNA结构之父美国科学家詹姆斯·沃森英国科学家弗朗西斯·克里克 四、性质： 切断识别部位或其附近特定部位后，产生两种末端，即平齐末端和粘性末端（5’突出端和3’突出端）。 掌握利用限制性核酸内切酶酶切DNA的原理和方法。 实验目的： 实验原理： 限制性核酸内切酶是基因工程中最常用的工具酶。其作用特点是特异识别DNA分子中的碱基序列（一般为4-6个碱基对的反向重复序列），酶切后产生平齐末端或粘性末端。 本实验采用EcoRI酶切提取的质粒pUC18。 试剂： 10×限制酶缓冲液 限制酶EcoRI pUC18 设备： 微量加样器 离心机 水浴锅 实验方法： 1、配制酶反应混合液，每20ul反应体系包含： 10×限制酶缓