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第3 章 高效液相色谱分析 第三章 高效液相色谱法 （High Performance Liquid Chromatography ，HPLC ） 教学要求 1. 了解高效液相色谱仪的一般构造流程及部件 2. 熟悉解高效液相色谱法色谱条件的选择 3. 掌握液相色谱的各种分离机理及适用对象 4. 掌握各种检测器的原理及特性 5. 掌握常用液相色谱固定相及流动相的特性及选用原则 重点：高效液相色谱主要类型及分离原理 难点：高效液相色谱主要类型及分离原理；液相色谱固定相；高效液相色谱分 离类型选择 课时安排：4 学时 §3-1 高效液相色谱的特点 液相色谱法是最早发明的，但初期发展比较慢，反而是气相色谱的理论与技 术发展迅速。直到20 世纪70 年代初，研究人员将已经发展得比较成熟的气相色 谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。现代液相 色谱采用高压输液系统输送流动相，且具有分析速度快、分离效率高等特点。 -9 目前，HPLC 可以在半小时内分离出尿样中的104 个组分。检测限可达10 g -11 （紫外）和10 g （荧光）。所以，人们称它为高效液相色谱法 （High Performance Liquid Chromatography ，HPLC ）又称高压、高速或现代液相色谱法。 1、特点 5 （1）高压 （150-350 ）×10 Pa （2 ）高速 （3 ）高效：大于30000 塔板/米 -9 -11 （4 ）高灵敏度：10 g （紫外检测）、10 g （荧光检测） 采用高压泵输送流动相，梯度洗脱，可在柱后直接检测流出液成分，通过改 变溶剂极性或强度进而改变色谱柱效能，分离选择性和组分的容量因子，实现改 善色谱系统分离度的目的。 气相色谱技术虽然比较成熟，但它只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的 有机化合物，而70 ％以上的化合物低挥发、大分子量、极性强、具有生物活性、 3-1 第3 章 高效液相色谱分析 热稳定性差的物质。HPLC 恰好弥补了GC 的不足，现在，HPLC 的应用范围已 经远远超过气相色谱。 但HPLC 设备昂贵，柱填料和流动相价格高，因此，应用普及受到限制。 2 、HPLC 与GC 差别： （1）分析对象的区别 GC ：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性 差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测，占 有机物的20% 。 HPLC ：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发 性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和 离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%。 （2 ）流动相差别的区别 GC ：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互 作用。 HPLC ：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、 改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相 极性和pH 值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作 为流动相也可以增大分离选择性。 （3 ）操作条件差别 GC ：加温操作 HPLC ：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） §3-2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 1、涡流扩散项 He H = 2 λd e p 同GC：λ为填充不规则因子，dp