载体片段连接技巧.docVIP

. . 我首先酶切得到带有粘段的载体和目的片段,然后分别补平,再做载体去磷酸化,最后将载体和目的片段连接,转化,可是只可怜昔昔的长出3个单菌落,我还得鉴定正反向,怎么办?平端连接效率真这么低吗?请大家传授自己的经验.欢迎大家以此帖为引展开“平端连接”讨论！ 我曾经作过跟你类似的实验。1）目的片段和载体的质量最好高一些。2）按照常规连接体系进行，一般20ul体系。3））连接温度20-25度。由于平端连接不涉及粘性末端的互补，所以温度可以高一些。4）酶的用量不要过量，按照说明就可以。5）连接时间至少4h，能过夜就过夜。6）转化的时候：休克后加入培养基，孵育50min，最多不超过1h，转速不要高，大约150-170rpm。然后稍加离心弃去上清，留下大约200ul涂板子就可以了。 在我的平端连接试验中，我曾经尝试过将目的片断抽真空变成干粉后，以较小体积重新溶解后再与目的载体连接，我觉得这样效果也不错。另外，平端连接反应最好在16度环境中过夜。 1) 提高目的片段浓度无论对于粘性末端或者平端连接都是很有促进作用的；2）就连接的温度而言，一般粘性末端选择16C，而平端连接选择20-25C，我特地查了一下，NEB公司的平端推荐温度也是20－25C。连接的过程中涉及大量个事件：粘性末端突出部分的退火互补；两端序列5-3之间在连接酶的作用下进行连接。两个事件互相促进。在粘性末端连接中，2种因素都起作用。但是，连接酶的最佳活性温度是37C，退火互补需要温度降低，连接酶发挥作用需要温度提高，所以就权衡一下，实践摸索16C是粘性末端的最佳连接温度。平端连接中，不存在粘性末端那样突出序列要互补的问题，所以要尽可能的照顾连接酶的活性。那为什么不用37C？因为这个时候虽然酶的活性较好，但是不利于片段和载体之间的相互碰撞。所以，还是选择了20－25C。 screen.width-333)this.width=screen.width-333 width=139 height=139 title=Click to view full my.JPG (139 X 139) border=0 align=absmiddle 有启发！多谢！ 我的经验是:1， 平端连接需要过夜反应。2， 插入的DNA片段的摩尔数是载体摩尔数的5-10倍，这个很关键。载体通常50ng就够了，若你的载体在10k左右，可用50~100ng.3， 若你的载体很大，建议你用电转化。而且电转化前要纯化连接产物。 先谢谢楼上各位的指点，对我大有启发，我再重新做一次，希望能有好的结果。还有一个问题请教各位，补平之后，是否需要先回收再去磷？还是补平后直接加BUFFER和CIAP？ 如果补平后回收，然后CIAP，然后再回收，载体处理的更干净，可是会有损失。通常我是补平后用纯化试剂盒纯化,之后做CIAP, 然后跑胶回收。总之，1： 补平后不可直接做CIAP。至少要纯化后再CIAP。2： CIAP后一定要跑胶回收处理，因为这是连接前的最后一步，一定要干净。 关于平端连接的一点点补充：［优点］没有连不上的，只有切不开的！平末端连接不牵扯到粘性末端的碱基突出问题，所以，理论上任何两条DNA序列都能连接在一起，当然需要ligase的酶学作用了。这个不同DNA分子之间的连接带来了极大地便利，因为平末端自然是这样，而如果遇到5‘或者3’突出的粘性末端，也可以经过处理成为平末端。另外，有时候，两个平末端连接在一起以后，可以产生另一种内切酶的识别序列，为后续的克隆工作提供了一种机会。［缺点］1）连接效率比粘性末端低连接效率之所以比较低，原因之一是在连接过程中只有连接酶的作用，缺乏粘性末端那样突出碱基的互补作用；原因之二是常用的T4DNAligase对于平末端的Km值比粘性末端高1000倍。2）可能产生双向插入由于平端连接的末端没有特异性，连接的时候不能定向，所以两种方向的插入都有可能。这个时候就需要有一种有效的鉴定方法。一般分别在载体和目的片段选择一个酶切位点进行酶切鉴定，当然，具体的鉴定方法要根据具体的实验而定。3）可能多拷贝插入平端连接时，可能目的片段多个插入，并且在多个插入的时候还有可能每个插入子以不同方向连接，导致有时候结果难以解释。一般目的片段越大，多拷贝插入的可能就越小。 各位大侠：我现在在做三段连接，两段目的基因中一个用EcoRI和BspTI双酶切，有1.8Kb；另一个基因为100bp的片断，用NotI和BspTI双酶切。载体大片段用EcoRI和NotI双酶切，将他们放入一个连接体系里面连接，结果什么也没转化出来！！！郁闷啊！！！请问各位，怎么安排两个目的片段的比例？我用的酶是晶美的MBI的酶，