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2010级本科分子生物学实验设计 一、根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病 蚕豆病 蚕豆病简介 蚕豆病是一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PD）缺乏所导致的疾病，表现为在遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺陷的情况下，食用新鲜蚕豆后突然发生的急性血管内溶血。 临床表现 早期有恶寒、微热、头昏、倦怠无力、食欲缺乏、腹痛，继之出现黄疸、贫血、血红蛋白尿，尿呈酱油色，此后体温升高，倦怠乏力加重，可持续3日左右。与溶血性贫血出现的同时，出现呕吐、腹泻和腹痛加剧，肝脏肿大，肝功能异常，约50%患者脾大。严重病例可见昏迷、惊厥和急性肾衰竭，若急救不及时常于1～2日内死亡。 二、设计实验进一步明确诊断 红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性测定（紫外法） （一）实验器材和试剂 1.实验器材 恒温水循环紫外分光光度计，可见分光光度计，离心机。 2.试剂 （1）0.5mol/L Tris-HCl MgCl2缓冲溶液（pH8.0）：称取Tris12.1g,MgCl2·6H2O 4.06g,加入160mL蒸馏水溶解，用HCl调pH至8.0，然后加入蒸馏水至200mL。 （2）2 mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP＋)：称取NADP＋ 21.3mg，溶于10mL蒸馏水中。4 ℃可保存20天左右。 （3）6mmol/L葡萄糖—6—磷酸二钠(G6P－Na2)：称取21.5mg G6P－Na2·2H2O，溶于10mL蒸馏水中。4 ℃可保存20天左右。 （4）溶血剂：取巯基乙醇0.1mL，10% EDTA 2.0mL，6mmol/L NADP＋ 0.4mL，加蒸馏水至总体积200mL。 （5）血红蛋白氧化剂（Drabkin试剂）：称取K3Fe(CN)6 0.2g，KCN 0.052g，NaHCO3 1.0g，加蒸馏水至1000mL，置棕色瓶内避光保存，可保存20天。 （6）0.9% NaCl，ACD抗凝剂。 （二）实验操作流程 （三）注意事项 1.洗涤红细胞时禁止剧烈震荡，避免溶血。 2.测定NADPH时读取吸光度的时间要准确。 （四）结果分析 1.NADPH产量的计算 NADPH在340nm处，其每微摩尔的吸光系数（ε）为6.220，故10min内NADPH的产量计算公式为： NADPH产量（μmol）= 2.血红蛋白含量的计算 血红蛋白氧化为高铁血红蛋白以后，在540nm处，其毫摩尔吸光细数（ε）为44，故溶血液中血红蛋白的含量计算公式为： 血红蛋白含量（mmol）= 3.G6PD比活性（U/g Hb）的计算 G6PD比活性单位（U/g Hb） = = 三、从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果 红细胞膜的破坏 胆色素代谢异常  红细胞膜的破坏 还原型谷胱甘肽 体内重要的抗氧化剂 保护红细胞膜蛋白的完整性 说明 17——20为一个版本 22——31为另一个版本 参考一下看哪个你比较容易理解然后就用哪个 实验室检查 黄疸 皮肤，巩膜及黏膜等组织黄染 恶心，呕吐 全身无力 面色苍白 四、要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么目的基因？（选答） 基因结构分析法 我组讨论认为：要想探讨该病发生的分子基础 ，需要对目的基因进行基因结构分析，即DNA序列检测 双脱氧末端终止法（Sanger法） Sanger法是根据双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)在DNA合成过程中不能形成3’,5’-磷酸二酯键而导致链延伸终止的原理，利用四种ddNTP代替部分脱氧核苷酸（dNTP）作为底物进行DNA合成，从而获得在不同部位终止反应的大小不同的DNA链，结合高分辨率变性聚丙烯凝胶电泳分离，就可以对DNA序列进行分析。 五、患者体型瘦小与该病症是否有关，为什么？（选答） 患者体型瘦小与该病症有关 DNA序列测定方法 直接法 间接法：对于未知片段，或片段过长，用几种方法（RFLP；PCR-RFLP；SSCP）来粗略的估计待分析基因的一级结构是否与对照基因相同 双脱氧末端终止法（Sanger法） 化学裂解法（Maxam-Gilbert法） DNA的自动化测序 DNA序列测定方法 DNA链的方向是5? → 3? 交替的磷酸基团和戊糖构成了DNA的骨架 (backbone)。 （构成DNA） 脱氧核糖(deoxyribose) TAATCTGCAGGC 3’ 5’ 加入引物； 32P-dATP,dGTP,dTTP； DNA聚合酶 3’ TAATCTGCAGGC 5’ 5’ 3’ primer ddGTP ddATP ddTTP ddCTP ATTAG ATTAGACG A ATTA ATTAGA A