双荧光素酶载体构建试验报告-cloudfrontnet.pdf

双荧光素酶载体构建实验报告 实验简介 利用PCR 方法，根据KLF3 (Ovis aries) 3’UTR 序列信息设计其扩增引物，以Ovis aries 基因组DNA 为模板PCR 扩增KLF3 基因的3 UTR 序列，将其克隆到pmiR-RB-REPORT™双荧光素酶报告载体中，所用载体的报告荧光为hRluc ，校正荧光为hluc （做内参校正）。 实验步骤及结果： 一、基因序列分析 对基因序列及载体序列分析，可以利用XhoI ，NotI 两个限制性内切酶将目的基因片段克隆到载体中，载体图谱如下： 设计扩增引物如下： oar_KLF3_3UTR_F: GGCGGCTCGAGAGTGTTGCACTAATGTGGA oar_KLF3_3UTR_R: AATGCGGCCGCGAGTAGAAACAGAGAAGGAAC 红色分别为XhoI ，NotI 酶切位点序列，之前序列为保护碱基，引物扩增总长度为607bp 。 oar_KLF3_mut_F: TATATTTTTATTCGAAATAAGACTGAATGGGTA oar_KLF3_mut_R: GTCTTATTTCGAATAAAAATATATTACACTTTA 二、PCR 反应体系设计为30 μl 总体系，具体是5×Phusion Buffer 6 μl，2.5 mM dNTP mix 2.4 μl，上下游引物（10 μM ）各1 μl，Phusion DNA 聚合酶（2 U/μl ）0.3 μl，DNA 模板1 μl （约100 ng ），用灭菌水补足30 μl 体系。反应条件为（降落PCR ）：98℃2分钟预变 性，循环内98℃10秒变性，从65℃每个循环降1℃退火，72℃延伸30秒，10个循环；再98℃10秒变性，60℃退火，72℃延伸30 秒，进行15个循环；PCR 反应循环后72 ℃继续延伸3分钟，然后4 ℃保存。 PCR 反应完取5 μl PCR 产物进行1.5%琼脂糖电泳分析，如下： 备注：M: D2000 ；扩增大小与理论大小相符。 三、PCR 产物的纯化 按照凝胶纯化试剂盒说明书进行纯化产物。 四、酶切 用XhoI ，NotI 对上述纯化产物和载体进行双酶切，酶切反应体系如下：10×H 缓冲液 4 μl，DNA 约2 μg，内切酶(10 U/μl) 各1 μl，灭菌去离子水补足到40 μl。反应条件37℃，4小时。 五、酶切回收纯化 酶切后回收纯化酶切产物。按照纯化试剂盒说明书进行纯化产物。 六、连接 连接反应体系如下： 目的片段DNA 2 μl(约150 ng) ，载体0.5 μl(约50 ng) ，solution I 快速连接液5 μl, 灭菌去离子水补足到10 μl，16℃连接30分钟。 七、转化 1、取连接产物加到100 μl DH5α感受态细胞中混匀，冰浴30分钟。 2 、将上述转化液置于42 ℃水浴90秒，取出后立即置于冰浴中放置2-3分钟。 3、向其中加入900 μl 37℃预热的LB （不含抗生素）培养基，150 rpm 、37℃振荡培养45分钟。 4 、2500 rpm离心5分钟，将上清液吸走，留100 μl混匀菌液，加到含Amp抗生素LB 固体琼脂培养基上（抗生素浓度100 μg/ml ）， 用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。 八、菌落PCR 鉴定 挑取上述平板上的单菌落，溶到3 μl 水中，取0.5 μl 做模板，进行PCR 。反应体系设计为10 μl 总体系，具体是10×Taq buffer Buffer 1 μl，25 mM MgCl2 1.6 μl，2.5 mM dNTP mix 1 μl，载体上下游引物（10 μM ）各0.5μl，Taq DNA 聚合酶（2.5 U/μl ）0.3 μl， DNA 模板0.5 μl （约100 ng ），用灭菌水补足10 μl 体系。反应条件为95℃3分钟预变性，循环内95℃30秒变性，56℃退火，72℃ 延伸1分钟；20个循环； PCR 反应循环后72℃继续延伸3分钟，然后4 ℃保存。 实验共挑取5个菌落，进行PCR 。PCR 反应完取5 μl PCR 产物进行1.5%琼脂糖电泳分析，用载体上游和载体下游引物扩增 的条带理论大小为850bp 左右，其实际扩增条带如下： 备注：M: D2000 ；菌P 大小与理论大小相符。 九、将阳性的克隆送测序公司测序进