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色谱图多峰少峰问题分析 色谱图中未出峰 色谱图中出峰比预想的少 —进样问题:未进样或样品分解 —流动相问题:泵未输液或流动相不正确 —检测器设置不正确,或检测器有问题 —样品分解 —色谱柱柱效丧失 —用错流动相 —梯度洗脱时平衡不足(例如,过早将手动进样器扳至Load位置) 色谱图多峰少峰问题分析 色谱图中出峰比预想的多(鬼峰) —样品分解或制样时导入了杂质 —流动相被污染,或用错流动相 —流动相中含有稳定剂或稳定剂发生变化 —前次进样的后流出物(某些Rt值特别大的组分) —进样器被污染,洗针系统出问题或注射器脏 —未充分平衡进样器Loop管 —保护柱脏,色谱柱被污染,分辨率下降 额外的色谱峰 额外的色谱峰 额外的色谱峰 色谱峰保留时间问题分析 保留时间飘忽不定(各次运行之间) —系统不稳定或未达化学平衡 —泵压力不稳(泵头里有气泡) —进样体积过大或样品浓度过大 —温度波动 —流动相混合不均匀 —色谱柱被污染 色谱峰保留时间问题分析 保留时间增加或减少(各次运行之间) —系统不稳定或化学平衡不足 —泵流速变化 —温度变化 —色谱柱污染,柱效下降 —流动相被污染 —溶剂入口过滤器堵或管路堵塞 —系统渗漏 色谱峰保留时间问题分析 保留时间改变到一个新的恒定值 —流动相不正确或其组成不正确 —泵流速变化 —实际输液的流速不正确(泵失灵或故障) —环境温度变化；柱温不正确 —色谱柱尺寸或类型不正确 —色谱柱被污染 —流动相含有稳定剂或稳定剂发生变化 —输液系统的梯度滞后体积不正确 保留时间重现性：pH的影响 化学因素 — 中性物质：无影响 — 酸性物质：pH增加，保留降低 — 碱性物质：pH增加，保留增加 — 0.1 pH的变化会导致高达10%的保留时间变化。(pH在pKa +/- 1之内保留时间变化最大) pH稳定区域:方法稳定性更好 Thank you 能引起HPLC发生问题的潜在因素: 工作环境 电源及地线 流动相 泵 进样器 保护柱 在线过滤器 连接管路 色谱柱 检测器 数据处理装置 操作 逻辑判断及处理 问题 化学品 环境 仪器 *色谱柱/保护柱 *电源 *泵 *流动相 *地线 *进样器 *样品 *温度 *检测器 *湿度 *数据处理单元 *清洁程度 从最简单,容易之处入手: 如 1.停止流速; 2.去掉柱子; HPLC系统压力问题分析 问题:系统压力高 可能的原因: —温度太低 —流速太高 —流动相粘度大 —管路堵塞 —仪器或色谱柱堵塞 —压力传感器问题 HPLC系统压力问题分析 问题:压力低或没有压力 可能原因: —温度太高;流速太低 —泵关闭或保险丝断了 —泵未输送流动相 —系统内有渗漏处 —所用溶剂不正确 —自动进样器在Purge时卡住 HPLC系统压力问题分析 问题:压力低或没有压力 可能原因:（续） —储液瓶中无溶剂 —低压限设置不当 —泵未正确排气 —溶剂入口过滤头堵 —入口管路中有空气 —泵失效 HPLC系统压力问题分析 问题:压力不稳 可能原因: —压力传感器问题 —泵排气不充分 —泵失效 —流动相未正确脱气 —所用溶剂不混溶或易挥发 在线过滤器 单向阀 吸滤头 HPLC系统压力问题分析 单向阀的清洗如果使用过缓冲盐溶液请使用40 ℃ ~50℃的温水超声20min 如果使用过纯乙腈请使用异丙醇超声20min 如果使用过其他流动相或上述两种溶液超声后请使用纯甲醇超声20min HPLC流路基线噪音问题分析 基线不稳定(不重复) —检测池中有大的气泡 —流路中有小气泡流过 —系统未稳定或未达到化学平衡 —流动相被污染 —检测器流动池漏 —色谱柱污染 HPLC流路基线噪音问题分析 基线漂移 色谱柱有其他组份被洗脱出 - 冲洗, 直至基线稳定 溶剂发生变化 (如溶入气体或溶剂挥发) - 氦气或脱气机脱气, 溶剂瓶避光,密封(但要注意防止溶剂瓶内产生负压) 系统有漏液之处 - 检漏并处理 环境温度影响 (尤其对示差,电导,电化学检测) - 室温,柱温,检测池温度控制 环境湿度影响 对光检测器有较大影响 反压变化 - 溶剂和样品过滤. 注意黏度过大的样品 HPLC流路基线噪音问题分析 基线周期性噪声 绝大多数情况