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Chapter12 酵母基因工程 酵母细胞结构图 现有：酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、多形汉逊酵母、烷烃利用型解脂耶氏酵母和粟酒裂殖酵母。 主要应用于： 改造酵母本身提高发酵性能 利用酵母作为宿主表达异源蛋白 (1)将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母 酿酒酵母只能利用单糖、双糖和麦芽三糖，而占麦芽汁总糖25％的多糖和糊精不能被利用，导致啤酒的高热量。 将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母中，可以自身分泌葡萄糖淀粉酶，从而利用多糖和糊精。 (2)将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母 麦芽汁中残留的大分子蛋白质很容易影响啤酒的胶体稳定性，而酿酒酵母的胞外蛋白质酶活力很弱，很难水解蛋白质。 将外源的蛋白质水解酶导入酿酒酵母基因组中，利用自身分泌蛋白质水解酶可以降解一些大分子蛋白质。 (3)将β-葡聚糖酶基因导入酿酒酵母 大麦的β-葡聚糖酶不耐热，在发芽和糖化过程中极易被破坏，同时啤酒中残留的β-葡聚糖易引起过滤困难，形成冷凝物、沉淀物和胶凝等问题。 将β-葡聚糖酶基因导入酵母，可以有效降解麦芽汁中的β-葡聚糖，改善啤酒的过滤效率。 (4)将ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸激酶基因在酿酒酵母体内表达，可以促进SO2的生成，可以维持啤酒风味的稳定。 (5)将人血清清蛋白HAS基因转化到酿酒酵母，可以生产富含HAS的啤酒新品种。 表达水平：大多达到1g/L，高达10g/L。 高效表达的实现： 开发高效启动子提高和控制外源基因的转录水平(AOX1)； 提高表达载体在细胞中的稳定性； 通过多次同源重组以及rDNA介导的整合方式提高表达基因在细胞中的拷贝数。 表达质量：异源蛋白由于过糖基化导致潜在免疫性而不能医用，必须使表达的产物结构与天然产物一致。 提高表达质量：提高遗传稳定性，选用不同的酵母宿主 1.解决酵母基因工程中存在的缺陷 外源蛋白形成聚合体、信号肽加工不完全以及内部降解造成表达产物结构上有差异 2.应用于人类基因组计划 3.利用酵母基因工程筛选更多的新药 4.改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本 5.生理承受极限引起关注 (2)载体的复制形式 附加型载体 特点：拷贝数量大，传代中易丢失，影响重组菌的稳定性和表达量。 代表：2μm质粒和利用ARS的载体 整合型载体 特点：与酵母细胞染色体基因组DNA整合，稳定性高，但拷贝数低。 必须在酵母细胞内找到拷贝数很高的靶位点，位于第七号染色体上的rDNA单元，是100－200个拷贝的串联重复序列。 pPIC9k质粒图谱 安全无毒，不致病 遗传背景清楚，容易进行遗传操作 构建的载体DNA容易进入，转化效率较高 发酵周期短，培养条件简单，容易进行高密度发酵 蛋白质分泌能力良好 有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能 原生质体法 离子溶液法(Cs+、Li+) PEG1000法 电穿孔法和粒子轰击法 酿酒酵母：过度糖基化(＞40个甘露糖残基) 巴斯德毕赤酵母：8-14个甘露糖残基，分泌的糖蛋白的聚糖末端不含1,3-连接的甘露糖残基。 解脂耶氏酵母：8-10个甘露糖残基 1.酿酒酵母表达系统 附加型载体： 原核部分包括pUC质粒的复制起点和amp+筛选标记；真核部分包括酵母菌的2μm质粒的复制区和营养缺陷型相关基因。 启动子常用乙醇脱氢酶启动子PADH1，半乳糖诱导型启动子PGAL，分泌信号为自身α-交配因子，终止子用CYC1基因的转录终止子。 没有在酵母中复制的质粒复制区，而是利用同源重组将载体整合到染色体上。 特点是稳定性高，但拷贝数低。包括用于酵母转化的选择元件和原核部分的复制起点及筛选标记。 启动子：主要是酿酒酵母自身的高效表达基因启动子半乳糖启动子PGAL1； 信号肽：与酵母α-交配因子的前导序列融合，该引导序列可被Kex2酶切除。 用酵母转座子以产生多个插入拷贝 通过rDNA介导的重组插入到核糖体DNA簇中，在宿主的染色体上以约150个串联重复序列存在。 酿酒酵母表达系统的不足之处： 较难进行高密度发酵 蛋白质的分泌能力较差 甲醇营养型酵母是能在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基上生长的酵母，包括假丝酵母、汉逊酵母、毕赤酵母和球拟酵母 与酿酒酵母相比，甲醇酵母表达系统具有： 启动子强，受甲醇严格诱导，因此可调控外源蛋白的表达； 能对重组蛋白进行翻译后必要的剪接、折叠和修饰，糖基化更接近高等真核生物； 甲醇酵母在转化、基因替换、基因敲除等基因操作上与酿酒酵母相似，简单易行，但外源蛋白的表达量更高，比酿酒酵母增加10-100倍； 重组菌的遗传性稳定，表达量和分泌效率高，适合大规模发酵 能在无机盐培养基中快速生长，易进行工业化生产，高密度培养干细胞量可达100g/L以上。 以甲醇为唯一碳源和能源，诱导合成乙醇氧化酶(alcohol oxidase,AOX), AOX由AOX1和AOX2两个基因编码，约