GE中低压层析柱柱效测定方法详解.docVIP

GE中低压层析柱 柱效测定方法 柱效测定是一项经常使用的操作，对于定量表征层析柱的工作状态是否良好， 工艺的验证具有重要的意义。但是实际工作中很多朋友都遇到不会测柱效或者 测出来注销过低的状况，不知道如何解决。所以今天我就给大家详细介绍一下 柱效的正确测定方法，以及经常遇到的问题如何解决。 本方法适用于所有 GE公司中低压液相色谱的预装柱及自己填装的层析柱。 介绍分为 5 个部分，测前准备、试剂选择、测柱效操作、测试结果积分、经常 发生的问题。 1. 测前准备： ⑴?KTA层析设备。要求设备的型号与层析柱大小匹配，从上样阀门到紫外和电 导检测器之间的体积要做到最小 （管路内径尽量细，管路尽量短），这对于准 确测量实验室小层析柱的柱效非常重要。 ⑵测试平衡溶液及样品。这个部分在试剂选择中单独细说。 ⑶装填好的层析柱。使用平衡缓冲液在测柱效的流速下至少平衡 1.5 CV（柱体 积），平衡方向与测柱效方向必须 一致 ⑷样品环。容积大于 1%柱体积。 2. 试剂选择 测柱效主要有两种测试系统： 1 NaCl 测试系统； 2 丙酮测试系统。只要操作正 确，两个系统测出来的结果是 基本一致的。但是要注意：各试剂的浓度不能随 意改变，否则影响测试结果。 ⑴NaCl 测试系统 对于所有种类的柱子和填料，都可以使用氯化钠系统测柱效 平衡液： 0.4 M NaCl 水溶液 样 品： 0.8 M NaCl 水溶液 3. 测柱效操作 测柱效全程使用 30 cm/h 线性流速。平衡层析柱至少 1.5 CV，将 1% CV的样品 （NaCl 或丙酮）注射进入层析 柱，使用平衡液冲洗直至电导或紫外 280nm出 现响应峰。 4. 测试结果积分 以 UNICORN版6 本为例演示给大家看如何操作（各 UNICORN版本操作基本一致）。 以 NaCl 系统测柱效的所 有操作针对电导曲线，以丙酮系统测柱效的所有操作 针对 UV 280 曲线（手头没有测柱效结果，所以随便找 了一个图，里面有两个 峰。大家测柱效的结果只有一个峰） 1) 在 Evaluation 窗口中打开测柱效结果文件，在 Curve 窗格中点击右键，选 择 Customize 2) 勾选复选框去掉不需要显示的曲线 3) 在工具栏中点击峰积分按钮，进行积分处理或者在 Integrate 下拉菜单中点 击 Peak Intergrate 进行积分 处理 4) 选择需要积分的曲线以及积分表存储位置，基线类型默认为 Calculatebaseline 5) 在积分窗口中点击 Peak Window，出现以下窗口，通过拖动左右两条直线可 以选择需要进行积分的范 围，点击 OK确认 6) 在积分窗口点击 Reject Peaks 对需要分析的色谱峰可进行高级定义，包括 最小峰高、峰宽、峰面积、 峰个数等，在这里最常用的是在 Peakarea is less than 输入需要显示的最大峰的个数，点击 OK确定 7) 在 Column height (bed height) 一栏中输入柱床高度，在柱效测定中此项 必须填写 8) 点击积分窗口中 Save and Edit Peak Table 按钮，可以对峰进行高级操作 9) 点击积分窗口中的 OK，查看积分结果 10) 在 Peak data 区域点击右键，选择 Customize 在 Select peak table columns 对话框中找到需要显示的数据， plate height （HETP）、Asymmetry 等， 点击 O K执行。 Peakdata 区域中将会显示增选的分析结果 判断层析柱柱效是否合格的标准是 Plates per meter 和 Asymmetry。Plates per meter 要求大于说明书上要求的最低限（如 3000 或20000），或 者1000000/平均粒径/3 ( 计算出来就是说明书上的值 ) 。Asymmetry要求处于 0.8~1.8 之间。满足这两点，说明柱子装填没问题。 5. 经常发生的问题 如果不幸你测出来的柱效不合格，请检查以下原因： 影响柱效的可能 原因 对策 柱子装填不均匀 重新装柱 管道中液流不稳 定 NaOH清洗系统；平衡柱子 1.5CV 以上 柱子中有气泡 溶液脱气；反压阀在线，冲洗足够长时间 凝胶有结块现象 拆掉层析柱， NaOH清洗凝胶后重新装柱；换 新的凝胶 柱子液流分配不 好 换分配器或层析柱 系统死体积大 换细管路；短接柱位阀 样品体积太大 上 1%柱体积 流速太快 使用 30 cm/h 线性流速