葡萄果实单萜生物合成相关基因转录及萜类物质积累规律-中国农业科学.pdf

中国农业科学 2014,47(7): 1379-1386 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.015 ‘亚历山大’葡萄果实单萜生物合成相关基因转录 及萜类物质积累规律 1 2 1 3 1 1 1 1 孙 磊 ，朱保庆 ，孙晓荣 ，许晓青 ，王晓玥 ，张国军 ，闫爱玲 ，徐海英 1 2 3 （北京市农林科学院林业果树研究所，北京 100093； 北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083； 中国农业大学食品科学与 营养工程学院，北京 100083） 摘要：【目的】检测‘亚历山大’葡萄果实中萜类物质的种类和含量，分析果实发育过程中单萜类物质的积 累与相关基因表达的关系，为揭示玫瑰香型葡萄香气物质的积累规律和香味育种奠定基础。【方法】从果实转色后 至成熟期，每周取样一次，每次随机取样80—100 粒，去籽去梗后榨汁，离心取上清液用于香气物质测定，使用 顶空固相微萃取方法萃取样品中的挥发性成分，对采集到的质谱图用NIST 05 谱库检索，并根据已有标样的色谱 保留时间和保留指数，确定香气成分的化学组成，利用已有的化合物制备标准曲线进行定量。根据DXS 的ORF 序 列设计引物，以充分成熟的样品RNA 反转录获得的cDNA 为模板，通过多次独立PCR 扩增获得‘亚历山大’DXS 的 ORF 片段，根据测序结果分析单核苷酸多态性位点。根据萜类生物合成途径中的 8 个关键酶基因序列设计引物， 使用Ubiquitin，EF1-α和GAPDH 3 个看家基因做为内参，进行实时定量PCR，检测这些基因的转录丰度。【结果】 从转色后至成熟期，在检测到的所有单萜中里那醇和香叶醇的含量远高于其它单萜，多种萜类浓度逐渐上升，其 中里那醇、月桂烯、柠檬烯上升6—8 倍，香叶醇、萜品醇、香叶醛和萜品油烯上升 2—3 倍，玫瑰醚和橙花醛含 量变化较小，果实中里那醇、香叶醇、氧化玫瑰和月桂烯的含量高于嗅闻阈值。在单萜生物合成早期途径中，DXS1 的表达从转色开始缓慢上升，在花后15 周迅速上调，上升约 5 倍。DXS3 则从12 周开始迅速上升。DXR 表现出波 动变化规律。HDR 的表达量在前期合成酶基因中是最高的，能达到DXS1、DXS3、DXR 的10—20 倍；在合成途径中 期的2 个基因FPPS 和GPPS，从转色后至成熟期表达量持续上调，FPPS 的表达量上升了4 倍，GPPS 的表达量上升 了2 倍；在合成途径的后期，Liner-syn 和Terp-syn 在花后的11—15 周都出现表达量升高，所有基因在花后 17 周出现明显的表达下降。单萜总量从花后 12—16 周迅速积累，这与同期DXS3、DXR、HDR、GPPS、FPPS 的表达上 调的趋势相一致。通过相关性分析结果显示萜类总量与DXS3 的相关系数为0.831。‘亚历山大’DXS1 的cDNA 的开 放阅读框全长 2 151 bp，编码 716 个氨基酸，通过多次独立克隆后对测序结果进行比对，在该序列中发现了 16 个单核苷酸多态性位点，导致4 个位置编码的氨基酸发生变化。【结论】单萜合成途径中多个关键酶基因后期表达 上调，导致成熟过程中单萜化合物含量上升2—8 倍，DXS3 与单萜总量的积累具有显著的相关性。 关键词：亚历山大葡萄；萜类；生物合成；反转录聚合酶链式反应 Terpenes Biosynthesis Related Gene Transcript Profiles and Terpenes Accumulation of ‘Alexandria’Grape 1