第四章酶学分析技术.pptVIP

* 例：碘色法测定血清淀粉酶（AMS） 【单位定义】 1惯用单位：100ml血清AMS在37℃15min，水解5mg淀粉。 【操作】 测定管：稀释10倍后的血清0.2ml中加0.4g/L的淀粉溶液1ml37℃水浴7.5min后显色。 校准管(“对比”校准管)：用蒸馏水替代血清，其它步骤相同。 反应完成后，660nm处以蒸馏水调零，分别测出△Au、△Ac。 【计算】由式5.4有： * （三）采用酶活性国际单位的计算公式 1．用微摩尔吸光系数（με）表示的国际单位计算公式 摩尔吸光系数ε是表示吸光度与摩尔浓度（mol/L）、光 径（cm）之间关系的一个法定计量单位. 摩尔吸光系数 微摩尔吸光系数 毫摩尔吸光系数 * 在连续监测法测定酶活性时，tu为酶促反应曲线线性期内时间变化值（亦可表示为△tu ），△Au为线性期内测定管吸光度变化值 上式中ε：摩尔吸光系数，Cu：样本摩尔浓度（原始浓度），l：比色杯光径。注意Cu/nu为比色杯中的样本摩尔浓度（比色浓度）。 根据酶活性国际单位的定义：m0=1μmol，t0=1min。常取规定样本体积V0=1L 。相应地，tu计量单位为min，ε变为με的L·μmol-1·cm-1，l为cm，则用微摩尔吸光系数（με）表示的国际单位计算公式由上式可简化为： 　　　　　 　 (5.5) * 另外一种推导方式 将比尔定律△Au =εCul/nu两边同时除以tu，结合样本稀释倍数展开后得到 * 0.2ml样本中加入底物液于37℃15min，终止反应后总体积为 5.2ml。405nm处以空白管调零，1cm比色杯中测△Au。已知对硝 基酚在该条件下的ε为18 380 L·mol-1·cm-1。 例: 对硝基酚比色法测β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）。 【计算】由式5.7有 * 2．用毫摩尔吸光系数（mε）、摩尔吸光系数（ε） 表示的国际单位计算公式 在吸光系数的数值关系上，以340nm处NADH（还原型尼克酰胺腺嘌呤二核 苷酸，还原型辅酶Ⅰ）在一定条件下的吸光系数为例： 　　　　　　　　ε= 6.22×103 L·mol-1·cm-1 　　　　　　　 mε = 6.22 L·mmol-1·cm-1 　　　　　　　 με= 6.22×10-3 L·μmol-1·cm-1 可见，mε值 = 103με值，ε值=106με值，各代入式5.5后有： 　　 　　 　 （5.6） （5.7） （5.8） * 3．计算因数与测定产物生成类、底物消耗类的吸光度变化 方向的关系 式5.5、式5.6、式5.7中△Au/tu以外的部分都相等，称为计算因数 Factor值（简称F值，或K值）： 　　　　　　　 　（5.9） 由式5.9展开后可见，F值的单位是μmol/L。不作校准时可采用试剂盒 厂家给定的F值. * 4．国际单位间无可比性 国际单位数相同的不同酶并不表示酶含量相同，因为其具体反应条件不尽相同，酶的激活与抑制状态也不相同，故国际单位之间无可比性。 一般用分光光度法测定酶活性，也可用荧光法测酶活性。荧光法测定酶活性的计算式与分光光度法计算式相似，仅将式中的吸光度A换成荧光强度F即可。 （四）katal单位与国际单位间的关系式 据定义，1katal = 1mol/s = 106μmol/(1/60min)= 60×106μmol/min = 60×106IU 1nkatal = 0.06IU 1IU = 16.67nkatal （五）荧光法测定酶活性单位的计算公式 * 二、酶活性单位的校准(了解) 两种方式： 一是用实际测定的摩尔吸光系数ε进行校准； 二是用酶校准物（calibrator，校准品）来校准。 速率法测酶活性时，需要用实际测定的ε来计算真实的K值：将已知浓度的生色物如NADPH（还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，还原型辅酶Ⅱ）、对硝基苯酚等，或底物如葡萄糖等作为样本进行酶活性测定，测出吸光度变化值后计算出真实的K值，再代入连续监测法公式可以比较准确地计算出样本酶活性含量。 用实际测定的摩尔吸光系数ε进行校准: * 第三节 酶活性的测定 测定方法分类： 按照仪器检测方法分类：分光光度法、浊度法、荧光法、 放射性核素法、电位滴定法、电极法、量气法。 按照反应时间分类；分为定时法、连续监测法和平衡法。 按照检测对象分类：分为直接法和间接法。