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实验四超氧化物歧化酶测定 高级植物生理实验报告 植物抗性生理 农学院 农药学 东保柱 2013202054 2013 年 12 月 27 H 实验1超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛含量的测定 (操作步骤) 1试剂配制 1.1磷酸缓冲液(PBS)配制 注：配成PBS2000ml,其中1000ml用于A液配制，另1000ml用于酶 液制备。1.2其它溶液配制 2酶液制备 称取植物材料lg,加少许0.05mol/L pH7.8的磷酸缓冲液在冰浴中 研磨，最终定容制得10 ml匀浆。转移至10ml离心试管中，在3000 rpm 下粗离心1分钟,粗提液再转移至2个5ml离心管中，在冷冻离心机13000g 4 °C下离心20分钟，上清液即为酶液，用于SOD活性和丙二醛含量的测 定。 3丙二醛含量测定 吸取酶液2 ml-加入F液2 ml-沸水浴加热15分钟(呈粉红色)一快速 冷却-4000rpm下离心5分钟。若以种子为材料，则加热后溶液混浊，需 增加离心力。以F液为参比液,分别在532nm和600nm处测定光密度值。 丙二醛含量(nmol ? g)= 式4 V/v -提取液总量(10ml) /测定液用量(2ml) R—反应液总量(4 ml) W…植物材料鲜重或干重(g) 0.155 —丙二醛的摩尔浓度消光系数(^[MDA]=lnmol/ml 时,OD532-OD600=0.155) [即(OD532—OD600) / 0.155 的单位为 InmolMDA / ml ] 室温下处理的叶片在523nm出的光密度值 室温下处理的叶片在600nm出的光密度值 室温下丙二醛含量(nmol ? g-1) =-0.0022+0.039/0.155x4x10/2x1=4.75 nmol g-1 冷处理下的叶片在523nm出的光密度值 室温下处理的叶片在600nm出的光密度值 冷处理下丙二醛含量(nmol ? g-1) =0.077-0.026/0.155 X 4 X 10/2 X 1=6.58 nmol ? g-1 4超氧化物歧化酶活性测定 4.1操作及说明 (1)按照下表加入各种溶液: 试管 处 理重复 编号A液 12 对照植株（处理1） II 22 I 32 胁迫植株（处理2） II 42 仪器调零液52无酶液（NBT还原100%） 6 2 按顺序加入各种溶液（ml） B》夜C液D》夜水0.10.12 0.10.12 0.10.12 0.10.12 0.10.1 ?20.1 0.1 2 0.1 光密度 （560nm ）ODODODODODO 酶液 0.10.10.10.10.1* ODmax *仪器调零液中的“酶液0.1ml,可以取对照植株的，也可以取胁迫 植株的。 ⑵将试管置于阳光下反应15分钟(NBT述原产物为蓝色)，然后在 560nm下测定光密度(OD560)。(3)若样品反应后蓝色很浅或无，则须减少 酶液用量后，再重复上表步骤；若样甜反应后蓝色极深或与无酶液同， 则须增加酶液用量后，再重复上表步骤。4.2计算 1个酶活单位 SOD 活性(u/g) = 定义:SOD抑制N盯还原50%时的酶液用量(ml)。 式中：U —1个酶活单位(ml) V-提取液总量(10ml)v-?测定酶液用量(0.1ml) W…植物材 料鲜重或干重(g) 5问题与讨论 5.1在自然光照下，蓝色几乎立即生成，至15分钟时基本稳定。但随 照光时间延长，酶会失活，蓝色 渐退。故照光时间以15分钟为好，不宜再长。 5.2光质、光强、时间、温度、试管质地等因素均对结果产生影响， 应尽量保持一致。5.3酶液用量应使处于合适范围之内，否则须加调整(见 4.1(3))。5.4酶液在反应液中所占比重较小，对OD影响也小。但如果浑 浊、有色，则需考虑其影响。 实验2游离脯氨酸含量的测定(前三酮法) （操作步骤） 1药品配制 1.1 2.5%的酸性苗三酮试剂：称取2.5g前三酮一加入60 ml冰醋酸一 加入40 ml 6 mol / L的磷酸一加热溶解一冷却贮于棕瓶中备用。（85%的 浓磷酸约为14.6 mol/L）o 1.2 3%磺基水杨酸：称取3g磺基水杨酸，溶 于100 ml蒸憾水中。 2标准曲线绘制 称取0.025 g脯氨酸，定容于500 ml蒸憾水中，配成浓度为50 M g / ml的脯氨酸母液。 在沸水浴中加热显色50分钟一冷却至室温一测定O D 5 2 0 3游离脯氨酸测定 3.1提取：称取0.5g植物材料一剪碎后放入试管中一加6ml 3%磺基水 杨酸一在沸水浴中提取10分 钟一3000rpm离心5分钟。上清液为脯氨酸提取液。3.2测定：提 取液1 m|f冰醋酸1 ml—苗三酮2 m|f水1 ml—沸水浴中加热显色50分 钟一冷却至室温一比色测定0 D 5 2 0（以蒸憾