光镊测量CENP-TW之间的相互作用力.pptx

光镊测量CENP-T/W之间的相互作用力 Optical Tweezers 2 Scattering force Gradient force manipulation and detection of sub-nanometer displacements Our Setup 3 Calibration 4 Calibration 5 Feedback Control 6 等效半径法： 信息熵法： Cenp-T and Cenp-W 7 动点是细胞有丝分裂分子机器的主要结构。过去研究发现CENP-T/W/S/X复合体可以形成新形式的核小体结构，成为动点的内层结构基础，其中CENP-T可以伸展到内层动点外侧，形成外层动点和内层动点连接的基础。2014年DevelopCell文章指出CENP-T可以参与有丝分裂过程中的张力调控。在此基础上我们推测AuroraB激酶可以调节CENP-T/W之间的相互作用强弱，帮助蛋白复合体抵抗有丝分裂过程中微管产生的张力，并对有丝分裂过程中染色体错误配对的修复起到重要作用。 Test Implementation 8 Coupling Method 为了实现这种方案，我们要先设计偶联方式将DNA与蛋白、微球连接在一起。 首先我们PCR制备了一端连有biotin，一端连有巯基的DNA分子。让DNA上的巯基与交联剂BM(PEG)2反应，反应方式如下： BM(PEG)2一端的马来西亚胺与DNA相连接，另一端与谷胱甘肽上的巯基反应，这样便可以在DNA的一端修饰上一个谷胱甘肽。 DNA的另一端带有biotin，会与带有streptavidin的微球产生特异性偶联。 然后使用这种微球到细胞裂解液中去捞取CENP-T/W，然后进行实验。 Stretching Results 10 A预拉伸的拉伸曲线 B拉伸曲线的蠕虫链拟合 C有力平台的拉伸曲线 Stretching Results 11   能拟合上且有平台 能拟合上但直接断开 不能拟合上直接断开（低力） 不能拟合上直接断开（高力） 拟合后发现为多分子行为 数量 4 2 6 7 4 断裂力 41.12 28.3 13.5 40.93 40.68 平台长度 289 - - - - Further Discussion 12 因为CENP-T/W和组蛋白具有同源性，同时有文献表明组装在DNA上的核小体可以被20-40pN的外力所拉断（Bennink, Martin L., et al. “Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers.” Nature Structural Molecular Biology 8.7 (2001): 606.），所以我们推测表格中低力断裂情形是蛋白与DNA发生了相互作用。因为蛋白在DNA上结合的实际位置不定，所以实际的DNA长度也不确定，因此曲线无法用理论拟合。这种情况的曲线一共有6 条，平均断裂力13.5 pN，占50%。 我们还要补充一些实验数据，提供更充分的数据；二来就是要对比磷酸化过后、非磷酸化的蛋白之间相互作用强度的变化，从而得到磷酸化对于有丝分裂的调控作用。