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神经细胞培养 第一节：细胞培养的基本知识 6 常用的培养用液及培养基 培养用液：水 　　　　　　　　平衡盐溶液（ＢＳＳ）（见表）作用： 　　　　　　　　消化液１胰蛋白酶液（０．２５%） 　　　　　　　　　　　２二乙烯四乙酸二钠（ＥＤＴＡ）　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　３胶原酶： 甘氨酸 羟脯氨酸敏感 培养基：1天然培养基（血清，血浆，组织浸出液，水解乳蛋白） 　 　　　　　 2 合成培养基（ＭＥＭ　ＤＭＥＭ ＨＡＭ`S F12　 　　　　　ＲＰＭＩ（１６４０）　１９９　Ｌ－１５ ）等 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 第 二节：神经细胞体外培 养的 基本概念和方案 神经细胞培养的类型 1 原代培养 原代培养（primary culture)：指从活体获得细胞、组织或器官在体外条件下进行的第一次培养 传代培养(subculture)：当细胞持续生长到达一定密度之后，就应当将细胞分成两部分（或更多）至新的培养器皿并补充新的培养液为传代培养。 2 细胞系培养 Neuroblastoma cells on silicon wafer 神经元网络在神经芯片上的定位培养 当前研究进展 研究硅基芯片的结构参数和神经元在芯片上的贴附性能的关系 多种神经细胞在具有纳米粗糙度的硅片上的培养后的存活和状态分析 改变硅基底纳米粗糙度 Ra 5nm-100nm. 改变培养细胞种类 不同的神经细胞可能会有不同的表面粗糙度要求。 培养条件的变化可能会导致细胞对表面粗糙度要求的变化，（有无血清） 神经细胞种类的选取 大鼠黑质细胞 nigra cells 大鼠脑干细胞，brainstem cells 神经母细胞瘤细胞 SK-N-SH neuroblastoma cells 鸡胚背根神经节细胞，DRG cells 粗糙度的不同导致细胞的活性差异 硅片，Ra=20nm 硅片，Ra=50nm 细胞呈现多种形态分化 硅片Ra=20nm 神经母细胞瘤细胞 生长密度很高 细胞膜电位正常 活性很高 Rh-123染色 荧光照片 100X 神经母细胞瘤细胞贴附良好， 开始分化并且形成网络 大鼠嗜铬细胞瘤株PC12的培养 PC12细胞；来源于大鼠嗜铬细胞瘤克隆 ，其具有嗜铬细胞瘤和肾上腺嗜铬细胞相关的表型。可以合成儿茶酚氨，在有NGF的作用下细胞停止增殖，生长出神经突起等特点。 优点：1）相当高的稳定性和同质性 2）分化程度高，对NGF有很强的反应 3）已经具备了PC12细胞的生物学特征的背景资料 所以常被广泛用于神经细胞分化和功能的研究 局限性 1 PC12 不能作为所有类型神经元模型 2 不能接受形成突触联系， 3 在NGF处理后仍然可以继续合成DNA 4 可能发生自发性突变和继发性变异 5 长期培养可能出现明显不同的细胞亚群而导致感性趣的表型消失， 一、 PC12细胞的常规培养 1）培养液：85%RPMI1640培养液、10%马血清、5%胎牛血清，也可用DMEM或 F12 2）培养的底物：PC12细胞对塑料和玻璃黏附能力较差，所以必须在培养前进行底物处理：胶原、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等 PC12细胞的培养和传代 1）PC12细胞 增倍时间为2.5—4天 实际可7-10天传代一次。 2) 传代比例为1：3或1：4 3）换液时间为2-3天 每次换液约为2/3 的培养液 4）通过机械分离进行传代培养---用吸管轻轻吹打 5）必须选择生长在胶原或着其他底物的细胞群体进行传代 PC12细胞的冻存和复苏 PC12细胞可长期冻存保种 过程： 细胞吹打从培养皿脱落，离心收集，并悬浮于10%DMSO的完全培养液中，用冻存管分装细胞悬液，方法 为每分钟-1 °C的速度降至-60 °C，或者放入-80°C 过夜 ，可达6个月。 长期冻存可放置于液氮罐中。 复苏：37 °C 水浴中快速复温，离心漂洗去除冻存液后 重悬浮于完全培养液。 PC12细胞培养常出现的问题 1） 细胞生长不良 血清问题或 密度过低 2）细胞贴壁不良 3）对 NGF 反应不良 —— 细胞群体变异、NGF 失活 神经生长因子（NGF)的处理 1 神经纤维的生长研究：1） 细胞密度(2.5~10)x104 2)合适的底物处理方案:NGF可减弱细胞对塑料培养皿的黏附能力 3)NGF的浓度: 工作浓度为 2nmol/l储存浓度为 250μg/ml， 溶剂为醋酸钠缓冲液(ph=5) 温度为-80