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神经细胞培养 第一节：细胞培养的基本知识 6 常用的培养用液及培养基 培养用液：水 　　　　　　　　平衡盐溶液（ＢＳＳ）（见表） 　　　　　　　　消化液１胰蛋白酶液（０．２５%） 　　　　　　　　　　　２　二乙烯四乙酸二钠（ＥＤＴＡ）　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　３胶原酶 培养基：天然培养基（血清，血浆，组织浸出液，水解乳蛋白） 　 　　　　　合成培养基（ＭＥＭ　ＤＭＥＭ ＨＡＭ`S F12　 　　　　　ＲＰＭＩ（１６４０）　１９９　Ｌ－１５ ）等 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 第 二节：神经细胞体外培 养的 基本概念和方案 神经细胞培养的类型 1 神经细胞的原代培养 原代培养（primary culture)：指从活体获得细胞、组织或器官在体外条件下进行的第一次培养 传代培养(subculture)：当细胞持续生长到达一定密度之后，就应当将细胞分成两部分（或更多）至新的培养器皿并补充新的培养液为传代培养。 2 细胞系培养 Neuroblastoma cells on silicon wafer 神经元网络在神经芯片上的定位培养 当前研究进展 研究硅基芯片的结构参数和神经元在芯片上的贴附性能的关系 多种神经细胞在具有纳米粗糙度的硅片上的培养后的存活和状态分析 改变硅基底纳米粗糙度 Ra 5nm-100nm. 改变培养细胞种类 不同的神经细胞可能会有不同的表面粗糙度要求。 培养条件的变化可能会导致细胞对表面粗糙度要求的变化，（有无血清） 神经细胞种类的选取 大鼠黑质细胞 nigra cells 大鼠脑干细胞，brainstem cells 神经母细胞瘤细胞 SK-N-SH neuroblastoma cells 鸡胚背根神经节细胞，DRG cells 粗糙度的不同导致细胞的活性差异 硅片，Ra=20nm 硅片，Ra=50nm 细胞呈现多种形态分化 PC12细胞的培养和传代 1）PC12细胞 增倍时间为2.5—4天 实际可7-10天传代一次。 2) 传代比例为1：3或1：4 3）换液时间为2-3天 每次换液约为2/3 的培养液 4）通过机械分离进行传代培养---用吸管轻轻吹打 5）必须选择生长在胶原或着其他底物的细胞群体进行传代 PC12细胞的冻存和复苏 PC12细胞可长期冻存保种 过程： 细胞吹打从培养皿脱落，离心收集，并悬浮与10%DMSO的完全培养液中，用冻存管分装细胞悬液，放入-80°C 过夜 达6个月。 长期冻存可放置于液氮罐中。 复苏：37 °C 水浴中快速复温，离心漂洗去除冻存液后 重悬浮于完全培养液。 PC12细胞培养常出现的问题 1） 细胞生长不良 血清问题或 密度过低 2）细胞贴壁不良 3）对 NGF 反应不良 —— 细胞群体变异、NGF 失活 神经生长因子（NGF)的处理 1 神经纤维的生长研究：1） 细胞密度(2.5~10)x104 2)合适的底物处理方案:NGF可减弱细胞对塑料培养皿的黏附能力 3)NGF的浓度: 工作浓度为 2nmol/l储存浓度为 250μg/ml， 溶剂为醋酸钠缓冲液(ph=5) 温度为-80 4)作用时间 :10天左右,神经生长速度为50 μm/d 2 神经纤维再生: 研究NGF对神经再生的作用。 方法： NGF预处理一周 吹打 离心 ，去上清液 并重新接种，可2~3天重新形成网络，可冻存长期保存。 3 NGF去除： 研究NGF作用 方法：1）先更换培养液4-6次，间隔培养数小时再换2次，吹打细胞，离心漂洗4次，再接种。2） 用抗NGF血清 PC-12 cells -NGF +NGF 9 days +NGF 9 days +NGF 14 days 神经干细胞的分离和培养 NSC可定义为既可以自我更新又可分化为中枢神经系统内所有细胞类型的具有多向分化潜能的一类细胞。 神经干细胞的来源： 胚胎干细胞 成年的侧脑室下区（SVZ区） 和海马齿状回的颗粒细胞层（SGZ） 成人嗅球神经干细胞 骨髓基质细胞的转分化 诱导干细胞增殖和分化的营养因子 bFGF 对神经干细胞分裂和增殖具有重要作用 对胎鼠纹状体 海马 人胚胎干细胞的增殖和分化有重要作用。 EGF （表皮生长因子）对干细胞有分裂和增殖作用。 BDNF 使干细胞分化为神经元 CNTF（睫状神经营养因子） 定向分化为胶质细胞。 胶质细胞生长因子： 使干细胞分化为施万细胞 BMP（骨形