SEM扫描电镜样品制备及注意事项.pdf

第五章 扫描电镜生物样品制备技术 常规电镜样品要求： 必须是干燥的，不含水分或挥发性物质； 具有一定机械强度，能耐受电子束轰击； 具有导电性，被激发时能够产生足够的二次电子。 生物材料特点：含水分多，质地柔软，机械强度小； 组成元素的原子序数低，导电性差， 激发后二次电子的产额较少。 制样的任务： 通过一系列处理，既要尽量完美地保存材料的固有形态， 又要改良其物理性能，使其适合在电镜下观察成像。 主要内容：第一节 SEM样品的常规制备技术 第二节特殊要求的扫描制样技术 第一节扫描电镜样品的常规制备技术 菌类和组培细胞 粘样或滴样 熏蒸固定 干燥 冷冻 断裂 取 清 固 清洗 脱 干 粘 镀 镜 材 洗 定 水 燥 样 膜 检 管道铸型 腔形器 花粉、种子及孢子类样品 官 取材 一、取材 即：获取观察材料。 遵循五字原则：准、轻、小、净、浓 清洗 1.迅速准确：取材动作要快，部位要准确。 方法：因材料而异，通过破碎、解剖、切割、 固定 分离、提纯等手段，获取样品最佳观察面。 脱水 2.动作轻巧：保护好拟观察面。 解剖器械要锋利，不能对材料施加锯、挤、拉压 干燥 的外力。含水分多的、幼嫩材料最好冷冻断裂法。 3.厚度小：满足观察条件的最小体积，厚度为1~2毫米 粘样 4.纯净防混杂：花粉、孢子类样品注意防尘、防混杂 镀膜 5.悬浮液样品要求合适的浓度： 镜检 浓度太大造成样品堆积；浓度小则检出困难。 取材 二清洗： 清洗 1.完整的制样程序中有三次清洗 固定 固定前清洗：洗去表面的灰尘、黏液等附着物， 确保获得清洁的观察表面。 脱水  前固定后清洗：洗净醛类固定液，以免戊二醛与锇酸 干燥 反应而削弱锇酸的固定效果。 粘样  脱水前的清洗：洗净固定液，以免与脱水剂反应 产生沉淀影响观察效果。 镀膜 镜检 取材 2.清洗液的类型与选择：蒸馏水、生理盐水、加酶清洗液等 清洗  选择原则：清洗液的pH值、渗透压、温度应该尽量接 近样品材料的生理值，以免样品因环境突变而产生形变。 固定  选择方法： 脱水植物材料：蒸馏水洗净尘埃； 动物材料：等渗生理盐水、5%碳酸钠或缓冲液洗去黏液等； 干燥游离细胞：用等渗的缓冲液清洗(精子、血细胞、微生物) ； 覆盖大量黏液的样品( 胃黏膜)用低浓度的蛋白水解酶溶液洗； 组织培养细胞：用相应的培养液清洗； 粘样 特殊样品：如乳腺组织富含蛋白质和脂类，分别用16%的 甘油和20% 乙醇浸泡清洗； 镀膜表面附着蜡质、角质层的样品：用有机溶剂脱蜡。 镜检 取材 不同材料采用不同方法，灵活应用 3.清洗方法： 清洗 （1 观察气孔状态时应注意清