色谱分离技术.ppt

小分子 （二）凝胶过滤介质 基本要求： 不能与原料组分发生除排阻之外的任何其他相互作用，如电荷作用、化学作用、生物学作用 高物理强度、高化学稳定性 耐高温高压、耐强酸强碱 高化学惰性 内孔径分布范围窄 颗粒大小均一度高 常用的凝胶过滤介质 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 1. 葡聚糖凝胶 应用最广泛的一类凝胶。 由葡聚糖Dextran交联而得。 在制备凝胶时添加不同比例的交联剂可得到交联度不同的凝胶。交联剂在原料总质量中所占的百分数叫做交联度。 交联度大：网状结构紧密，吸水量小 交联度小：网状结构疏松，吸水量多 化学性质比较稳定，不溶于水、弱酸、碱和盐溶液 2. 琼脂糖凝胶 来源于一种海藻多糖琼脂，是一种天然凝胶， 不是共价交联，而是以氢键交联，键能较弱。 孔隙度通过改变琼脂糖浓度而达到（与葡聚糖不同） （联系琼脂糖凝胶电泳） 化学稳定性：琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶 没有干胶，必须在溶胀状态保存。 能分离几万至几千万高相对分子质量的物质，分离范围随着凝胶浓度上升而下降，颗粒强度随浓度上升而提高。 适用于核酸、多糖和蛋白质类物质的分离。 3. 聚丙烯酰胺凝胶 人工合成，在溶剂中能自动吸水溶胀成凝胶。 对芳香族、杂环化合物有不同程度的吸附作用。 （三）操作方法 凝胶的预处理 层析柱的选择 凝胶柱的装填 样品处理和加样 洗脱与收集 凝胶的保存 1、凝胶的预处理：充分溶胀 2、层析柱的选择 ① 体积 ② 柱比：层析柱的长度与直径的比 （样品的数量、性质、分离目的） 3、凝胶柱的装填 进胶过程宜连续、均匀、不中断，并不断搅拌。 4、样品处理和加样（样品的浓度、黏度） 5、洗脱与收集（洗脱液的成分、流速、目的物） 6、凝胶的保存（去除杂质） 六、高效液相色谱法 (High performance Liquid chromatography, HPLC) 高效液相色谱法： 特指一种以液体为流动相的色谱分离分析方法。它是在经典液相色谱的基础上，引入了气象色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。 （一）HPLC的分类和基本原理 固定相 液-液色谱 液-固色谱 作用原理 液-固吸附色谱 液-液分配色谱 凝胶渗透或体积排除色谱 离子交换色谱 亲和色谱 1.液-固吸附色谱 流动相—液体 固定相—固体吸附剂（活性吸附剂） 分离机制： 被分离的组分分子（溶质分子）与流动相争夺吸附剂表面活性中心，靠溶质分子的吸附系数的差别而分离。 与薄层色谱在分离机理上有很大的相似性，主要按样品极性的大小进行分离。 2.液-液分配色谱 流动相—液体 固定相—载体+固定液 以液体为流动相，把另一种液体涂渍在载体上作为固定相。 分离机制: 流动相与固定相互不相溶，两者之间有一明显的分界面，样品各组分借助于它们在两相间的分配系数的差异而获得分离。 （与液-液萃取的机理相似） 物理吸附 化学吸附 产生方式 分子力（范德华力） 库仑力(电子转移，生成化学键) 活化能 低 高 进行温度 低温 高温 释放热量 小 很大 速度 较快，容易达到平衡 慢，平衡慢 选择性 不严格 强 交换吸附： 吸附剂表面如果由极性分子或离子组成，则会吸引溶液中带相反电荷的离子形成双电层，同时放出等物质的量的离子，发生离子交换。 离子的电荷是决定因素，离子所带电荷越多，在吸附剂表面的相反电荷点上的吸附力越强。 电荷相同的离子，水化半径越小，越容易被吸附。 3.常用的吸附剂： 有机吸附剂： 无机吸附剂： 活性炭、纤维素、大孔吸附树脂、 聚酰胺 氧化铝、硅胶、人造沸石、磷酸钙、 氢氧化铝 按化学结构分 4.吸附色谱的基本过程和分类 固定相对各组分吸附力的大小次序： （1）过程 （2）分类 吸附薄层色谱法 柱色谱法 操作方法的不同 5.吸附薄层色谱法 （thin layer chromatography, TLC） 薄层色谱法：将吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上，铺成一薄层，然后把要分离的样品点到薄层的起始线上，用合适的溶剂展开，最后使样品中各组分得到分离。 （1）原理： 利用混合物中各组分的物理化学性质的差异，在层析过程中，在不相溶的两相中分布不同，从而达到分离的目的。 吸附剂：涂布在薄层板上 （固定相） 展开剂：在展开过程中流过固定相的溶剂 （流动相） 两相 将待分离的样品溶液点在薄层板的一端，在密闭的容