氨基酸纸层析.doc

本次实验项目： 　　　　　　　　氨基酸纸层析 本次实验课时：4学时 实验类型：验证性 教学要求： 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法 掌握氨基酸纸上层析法的操作技术（点样、平衡、展层、显色、鉴定）原理，能够对实验结果做出正确判断 重 点：：氨基酸纸上层析法的操作技术 难 点：纸层析法的基本原理 教学手段及教具：课堂讲授，学生实验操作。 讲授内容及时间分配： 课堂讲授 课堂讲授 1．实验目的……………………………………………………………………………… 0.2 学时 2．实验原理……………………………………………………………………………… 0.3 学时 3．仪器、材料和试剂…………………………………………………………………… 0.2 学时 4．操作步骤及注意事项………………………………………………………………… 0.3 学时 实验教学 氨基酸纸层析的操作……………………………………………………………………… 4 学时 参考资料 《生物化学实验》指导书 　　　　　　　实验教学教案首页 氨基酸纸层析法（验证性） 相关知识 1. 层析法（色谱法）：是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（称为固定相），另一个相则流此固定相（称为流动相）并使各组分以不同速度移动，从而达分离。 2．几种常用的层析法 ①吸附层析　②离子交换层析　　③薄层层析　 ④凝胶层析（凝胶过滤）　⑤亲和层析 ⑥分配层析（适于在水，有机溶剂中都可溶的混合物） 当把一种物质在两种不混溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀的分配。达到平衡时，这种物质在两种溶剂中的浓度之比是一个常数，即分配系数。 α α＝ 物质在溶剂II中的浓度 物质在溶剂I中的浓度 如果某一混全物的各组分在这两相中的分配系数有足够的差异，它们就可以被分离。 　3．氨基酸的极性大小及各氨基酸结构 一、实验目的 １．通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法 ２．掌握氨基酸纸上层析法的操作技术（点样、平衡、展层、显色、鉴定） 二、实验原理 纸层析法是分配层析的一种，以滤纸作为惰性支持物。层析溶剂（扩展剂）由有机溶剂和水组成。 在纸上水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。由于纤维素上的羟基具有亲水性，和水以氢键相连，使这部分水不易扩散，所以能与跟水混合的溶剂仍然形成类似不相混合的两相。当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上溶质就在水相和有机相之间进行分配，有一部分溶质离开原点随有机相移动而进入无溶质的区域，这时又重新进行分配，一部分溶质从有机相进入水相。当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断进行分配。溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的。 R Rf＝ 原点到溶剂前沿的距离 原点到层析点中心的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、PH层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。氨基酸、糖、核甘酸、甾体激素、维生素、抗生素等很多物质都能用纸上层析法分离。上层层析、下层层析、单向层析、双向层析。 三、仪器、材料和试剂 仪器：每组学生准备尺子、小剪子或小刀 1．层析缸、培养皿、量筒、小烧杯、长颈漏斗、毛细管、吹风机、电热鼓风干燥箱、层析滤纸、手套 、透明胶带。 实验材料和试剂 1．标准氨基酸溶液　分别配制0.5%的Lys、Ala、Ile、Met溶液 2．待分离测定的混合氨基酸溶液 ３．显色剂　0.1%水合茚三酮丙酮溶液。 ４．扩展剂（展层剂）：本实验使用酸溶剂系统 　酸溶剂系统：正丁醇:80%甲酸:水＝15:3:2（体积比），平衡溶剂与扩展剂相同。 四、操作步骤 １．层析缸：三个组共用一个。层析缸中放入三个培养皿（注意垫平）。 ２．配制酸溶液系统：每组用量筒用配制30ml入小烧杯，再放入层析缸中，作为平衡溶剂，密闭。 　　问题：平衡溶剂的作用是？ 3．戴手套取层析滤纸一张。在纸的一端(纵纹)距边缘1.5~2cm处用铅笔划一条直线，而后进行分隔（５个点）。 问题：为什么戴手套取层析滤纸？ 4．练习点样：用毛细管吸水在滤纸条上练习。达到均匀透过滤纸，大小不超过3mm的点样迹。 5．正式点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这5个位置上，干后再点一次。 　　注意：两次点样一定不要将不同的样品点在一个点上。小组成员认真仔细合作。不要用手触摸到滤纸。 6．点样面朝外，纸的两边不能接触。用胶带小条（1~2mm宽）将滤纸粘成筒状。 7．将筒状滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下），盖上层析缸盖，平衡约.10分钟。 8．将长颈漏斗置于筒状滤纸中并与培养皿底部接触，将约25mL左