使用微载体在生物反应器中制备Vero细胞狂犬病疫苗的试验1.docVIP

使用微载体在生物反应器中制备Vero细胞狂犬病疫苗的试验 一、材料 1、 微载体 GE公司Cytodex 1，25g 生物反应器 上海日泰公司Cellipower 5L，工作体积3.5L 加微载体25g（约7g/L） 细胞、毒种、培养液 二、操作过程 1、 微载体处理、反应罐准备 取微载体25g用PBS溶液洗涤几次后室温下浸泡膨胀过夜。弃去上清液，将载体转移到2L瓶内加入PBS约1L，灭菌后备用。 将微载体装到生物反应罐内，换上新的PBS溶液4L，安装好生物反应罐灭菌（126℃*80min）。 2、 生物反应器校正、调试 反应罐灭菌前调试生物反应器，确保能正常运行，各参数正常。用pH为7.0/10.0的标准缓冲液校正pH电极2次。灭菌后，温度37℃校正DO电极。 3、 预培养 DO电极校正完后，关闭进气，停止搅拌，过15分钟待载体沉降后排空上清液，加入199培养液3 L浸泡处理载体，浸泡3小时后同样关闭进气停止搅拌15分钟后排空上清液，加入7.5%新生牛血清培养液3L，设置温度37℃、pH7.2、DO 50、搅拌转速60RPM，预培养过夜，留意反应器运行是否正常，各参数是否稳定能调控。 接种细胞 接种细胞当天先排空反应罐内预培养的7.5%新生牛血清培养液，重新加入7.5%新生牛血清培养液3L，设置温度37℃、pH7.2、DO 50、搅拌转速60RPM。待温度稳定在37℃后取样校正pH值，然后准备接种细胞。 关闭温度、pH、DO控制，关闭进气，搅拌转速设为30RPM，将适量细胞悬液缓缓加入反应罐内，接种细胞总数为1.8*109个（密度约5*105个/ml），温度慢慢调回37℃，接种细胞后2小时开始进气，开启pH、DO控制，设置温度37℃、pH7.2、DO 50、搅拌转速30RPM。搅拌转速在接种细胞4小时后设为40RPM、5小时后设为50RPM、6小时后设为60RPM，开始进入细胞培养阶段。 批号定为 细胞培养 设置温度37℃、pH7.2、DO 50、搅拌转速60RPM并维持稳定，进行细胞培养。每天取样一次（2管）检测葡萄糖含量、进行显微镜观察。适当调整灌注量，维持葡萄糖含量大于1g/L。 接种病毒 细胞培养4天已长满，进行病毒接种。关闭进气，停止搅拌，过10分钟待载体沉降后排空上清液，加入1%新生牛血清培养液3L，10分钟后排空上清液，再加入1%新生牛血清培养液3L，设置温度35℃、pH7.4、DO 50、搅拌转速50RPM，待各参数稳定后取样校正pH值。关闭温度、pH、DO控制，关闭进气，搅拌转速设为30RPM，然后将50ml毒种接种入反应罐内。温度慢慢调回35℃，接种病毒后30分钟开始进气，开启pH、DO控制，设置温度35℃、pH7.4、DO 50、搅拌转速30RPM。搅拌转速在接种病毒3小时后设为40RPM、5小时后设为50RPM。接种病毒6小时后开始灌注1%新生牛血清培养液7L/天。开灌注前取样。 洗换 接毒第二天先取样，再洗换5次，每次加入199培养液4L，静置10分钟后排空上清液，洗换完加入0.1%人血白蛋白培养液3.5L，设置温度35℃、pH7.4、DO 50、搅拌转速30RPM。洗换后30分钟开始进气，开启pH、DO控制，设置温度35℃、pH7.4、DO 50、搅拌转速30RPM。搅拌转速在洗换3小时后设为40RPM、5小时后设为50RPM。洗换6小时后开始灌注0.1%人血白蛋白培养液7L/天，开始病毒液收获。 病毒液收获 灌注0.1%人血白蛋白培养液7L/天（收获3天后改为5L/天），收获病毒液。收获时每天取样，测抗原并进行显微镜观察。每两、三天的收获液收到一个50L桶内，每桶取样测抗原、DNA、HCP、毒力等。根据抗原检测结果确定收获天数。 下罐 培养结束后下罐，用1.0mol/L NaOH溶液处理反应罐及微载体2小时，再将反应罐、硅胶管等拆除清洗干净后烘干备用。 三、 细胞培养情况 日期 事项 残糖g/L 灌注量L 耗糖量g 其他 6-13 接种细胞 6-14 培养1天 3.13 0 3.74 6-15 培养2天 2.56 0.7 2.98 变酸，关CO2开进碱 6-16 培养3天 2.12 2.5 6.19 6-17 培养4天，接毒 2.7 6.5 5.43 凌晨变碱，开CO2关进碱 四、 病毒培养及收获液检测结果 1、 病毒培养情况 日期 事项 灌注量L 病毒收获液 其他 6-17 洗换 7 6-18 收获1天 7 6-19 收获2天 7 6-20 收获3天 7 ，14L 6-21 收获4天 5 6-22 收获5天 5 ，12L 6-23 收获6天 5 6-24 收获7天 5 6-25 收获8天 5 ，15