药物靶标发现与筛选 .ppt

三、蛋白质靶标 2、生色团辅助激光灭活(chromophore-assisted laser inactivation ,CALI) CALl能够直接对蛋白质进行操作，而不是通过对蛋白质量的变化进行检测。将标记有孔雀绿染料的非功能灭活抗体与特异性蛋白质结合，然后对蛋白质复合物进行激光照射。染料受激光激发短暂的产生活性分子，对结合的蛋白质造成破坏而起到灭活作用，但不影响其他蛋白质组分。 A lentiviral system for simultaneous knockdown and rescue with a functional EGFP-fusion complement. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;104(16):6702-6707 CALI of EGFP-CP induces the formation of dorsal ruffles and filopodia only in the knockdown/rescue background. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;104(16):6702-6707 CALI of EGFP-CP in KDR cells generates a local increase in barbed ends of actin filaments and dorsal F-actin. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;104(16):6702-6707 CALI of EGFP-Mena in Mena/VASP-deficient cells induces more stable lamellipodial protrusions Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;104(16):6702-6707 三、蛋白质靶标 3、蛋白质组技术 基 因 基因是一段DNA（脱氧核糖核酸分子）双链。 － 碱基成对出现: ATCGGCC TAGCCGG 基因表达中的信息流 中心法则（The Central Dogma） 蛋白质翻译 蛋白质结构的层次 一级结构 - 氨基酸序列 二级结构 - 主要由氢键稳固的局部构象， 如?-helix, ?-sheet等 三级结构 - 三维构象 四级结构 - 多个多肽链的组合 蛋白质结构的图形描述 分子表面 - 分子可视化 - 分子对接 - 基于结构的药物设计 - … 蛋白质组分析的首要要求 将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析 。 2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术 。 生物学问题的提出 实验模型的设计 实验组和对照组样品的制备 蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离 图像扫描和初步分析 感兴趣蛋白点的切取 胰酶对脱色后蛋白质的消化 质谱的多肽指纹图、微测序分析 质谱结果的生物信息学分析和比对 新蛋白质的发现 其它实验的进一步验证 蛋白信息的初步获得 蛋白质组研究的基本技术路线 蛋白质样品的制备 双向电泳 图像分析 转印至膜上的蛋白 凝胶中的蛋白 溶液中的蛋白 混合肽 蛋白质质量 N端测序 肽序列质谱数据 肽指纹图 数据搜索 新的或已知蛋白 蛋白转录后修饰的鉴定 蛋白质二维电泳： 蛋白质提取 样品前处理 一向等电聚焦 二向SDS—PAGE 凝胶银染及扫描 双向电泳分析软件分析 差异蛋白质点的质普分析 生物信息数据查询、建立蛋白质数据库 双向电泳分析中的样品制备 制备原则： 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。 可溶性样品 固体组织样品 细胞 不同样品的基本处理方法 样品的分级处理 通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。 样品的溶解 是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。 溶解的目标：1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）；