中药指纹图谱的方法验证-食品与药品教学中心.PPT

第三章 中药色谱指纹图谱研究过程中的关键问题 主要内容 第一节 方案设计与思路 第二节 样品选择与收集 第三节 样品的预处理 第四节 色谱条件选择 第五节 指纹特征选择 第六节 中药指纹图谱的方法验证 第一节 方案设计与思路 研究对象确定 研究方法选择 研究内容明确 研究对象： 在调研有关文献、新药申报资料(质量部分和工艺部分)及其它研究结果的基础上，尽可能的详尽地了解药材、中间体及成品中所含成分的种类及其理化性质，综合分析后找出成品中的药效成分或有效成分，作为成品和中间体指纹图谱的研究对象，即分析检测目标。 例如，黄芪含黄酮、皂苷及多糖三类有效组分，黄芪多糖注射液及其中间体的指纹图谱则以多糖为研究对象，黄芪原药材的指纹图谱应把黄酮、皂苷及多糖作为研究对象。 研究方法的选择? ? 研究方法应根据研究对象的物理化学性质来选择。大多数化合物可采用HPLC。例如黄芪中黄酮、皂苷、多糖等。挥发性成分应采用GC。例如鱼腥草中的鱼腥草素、土木香中的土木香内酯、异土木香内酯和二氢土木香内酯等。某些有机酸经甲酯化后亦可用GC分析。采用上述方法难以分离检测的成分，可考虑使用TLC和CE。 ? ? 一个中药制剂的指纹图谱可以同时采用多种方法进行研究。选择方法时，还需考虑药品检验系统复核时的设备、技术等因素。 研究内容　　根据国家食品药品监督管理局《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》(暂行)的规定，主要研究内容有原药材、中间体、注射剂的指纹图谱，涉及样品名称、来源、制备、测定方法、指纹图谱及技术参数等。 中药指纹图谱的建立 指纹图的获取 方法验证 指纹图的校验和复核 中药材指纹图谱 饮片指纹图谱 中药提取物指纹图谱 中药生产中间产品指纹图谱 中药各类制剂和相关产品指纹图谱 中药指纹图谱 指纹图谱的获取 指纹图谱建立和辨识 指纹图谱试验研究 对照品（参比物） 供试品收集 供试品制备 第二节 样品选择与收集 不同样品的收集原则 (1)切不可将同一批次样品分散成数个批次，充当样品。　 (2)原药材尽可能固定产地(GAP基地药材，地道药材)、采收期和炮制方法。对光线稳定，疗效稳定，无临床不良反应的药材批次应重点选择。? ?　 (3)中间体、注射剂样品的收集应重点选择工艺稳定、疗效稳定、无不良反应的批次。? ? (4)留样应不少于实验用量的3倍。 供试品的收集 真实性、代表性；收集量不少于 10 批 原始纪录 药材名称 供试品来源 药材名称收集时间及收集人 货源情况调查 基原鉴定及鉴定人 质量评估 供试品的留样、贮藏和标签 ◆ 原料药材 ◆ 半成品 原始纪录 半成品名称 混批前批号 日期 提取方法（关键技术） 混批后批号 中药指纹图谱 供试品的留样、贮藏和标签 ◆ 成 品 原始纪录 供试品批号 生产单位 供试品数量 供试品的留样、贮藏和标签 第三节 样品的预处理 不同样品的预处理要求 不同提取方法比较 样品预处理前后比较 药材供试液的制备 根据所含成分的理化性质，通过溶剂提取、液液萃取、沉淀、吸附等方法，分离富集样品。例如，黄芪中黄酮类成分通过碱的萃取、皂苷类通过大孔吸附树脂吸附；苦参中总生物碱通过阳离子交换树脂分离；挥发性样品常用水蒸气蒸馏法制备。? ? 样品富集后，还需通过氧化铝预柱、C18预柱、硅胶预柱、聚酰胺预柱等，除去色素等杂质，最后通过微孔滤膜，供HPLC测试。 供试品制备 取样 称样 制备 定容 放置 标签 避光、低温、密闭容器条件下短期放置 标示浓度 溶剂萃取、固相萃取、其他方法 供试品与选样1:10 具 有 代 表 性 与药材标号一致 对照品（参照物） ◆ 对照品（参照物）的作用 考察指纹图谱的稳定程度和重现性 有助于指纹图谱的辨认 ◆ 对照品（参照物）的选择 供试品种的活性成分或指标成分 指纹图谱中的稳定的指纹峰 内标物 ◆ 对照品（参照物）溶液制备 参照物的选择　　一般选取样品中容易获得且含量较高的一个主要活性成分或指标成分作为参照物（S）。参照物主要用于指纹图谱技术参数的确定，如特征峰(共有峰)的相对保留时间，峰面积比值等。并有助于图谱的稳定性、重现性的考查。例如三七药材的指纹图谱中以三七皂苷R1为参照物。　　由于指纹图谱比较复杂，内标物不易选择、插入，故一般不以内标物做为参照物。 第四节 色谱条件选择 HPLC色谱条件的确定与优化 ? 专属性 建立的指纹图谱必须能够表达该品种的特征 ? 重现性 同一品种同一样品指纹图谱中构成指纹特征的各特征峰（或斑点）作为整体（峰位、峰数、峰的丰度、各峰的大致比例）在不同实验室和不同操作者之间得到的色谱整体特征应有