高盐法提取DNA操作.docVIP

高盐法提取DNA操作 一 所需试剂 1 TNES抽提缓冲液：10 mM Tris-HCl； 400mM NaCl；100 mM EDTA；0.6 % SDS； 10M NaOH调节pH =7.5，高压灭菌； 2 TE 缓冲液：10mmol/LTris-HCl；1mmol/L EDTA； （浓）盐酸调节pH=8.0，加ddH2O定容至50ml，高压灭菌； 3 蛋白酶K （1mg/ml或20mg/ml），颠倒混匀； 4饱和NaCl；（5 M NaCl 5 无水乙醇或异丙醇（-20℃ 6 70％乙醇 7 ddH2O 二 操作步骤 1 准备小镊子、小剪刀、PE手套、卷筒纸、marker笔、写好标记的EP管及EP管插板、1000μl、100μl、10μl移液枪及大口径枪头，开水浴锅到55℃ 2 若为冷冻肌肉样品，则预先在EP管中加入400μl TNES缓冲液，再剪取30-50mg鱼类背部肌肉，在PE手套上用小剪刀尽量剪碎，放入EP管中； 若为酒精浸泡肌肉样品，则取酒精浸泡的鱼类背部肌肉约30-50mg，尽量剪碎，放入EP管中，置于烘箱中烘干（或室温放置半小时）至无酒精味，再加入400μl TNES缓冲液； 3 取出冷冻保存的蛋白酶K，待其稍解冻，每个EP管加入1μl 20mg/ml蛋白酶K（或加入20μl 1mg/ml 蛋白酶K），将EP管插浮板上，55℃水浴5-6h 注：水浴的过程中，开始每隔30min用小枪头轻轻搅动EP管中的肌肉8-10下，稍混匀，共搅动3次。注意动作要轻。 4 水浴结束后将EP管取出，（放冰箱）冷至室温，加入120μl饱和NaCl（或5M NaCl）和120μl氯仿； 5 将EP管放摇床上颠倒混匀5-10min，4℃，13000rpm离心25-30min 6 取出EP管，用大口径枪头吸取上清（400-450μl），加入2倍体积冷冻无水乙醇或异丙醇（约900μl），轻轻颠倒混匀5-6次； 7 将EP管插在浮板上放-20℃沉淀DNA 1h-1.5h 8 常温，13000rpm离心20min沉淀收紧DNA； 9 离心完毕可见EP管底部有小块白色或稍透明的白色沉淀，加入800μl 70%乙醇，摇床上颠倒混匀5min，13000rpm离心5min，弃上清（注意不要倒掉DNA沉淀）； 10 加入500μl 70%乙醇，摇床上颠倒混匀5min，13000rpm离心2-5min，弃上清（可用枪头吸尽残液，注意不要吸到DNA沉淀）； 11 打开EP管管盖插浮板上，放37℃恒温箱中或室温晾干约半小时 12 在EP管中加入50-100μl灭菌dd H2O或TE缓冲液，可轻轻吹打使DNA沉淀悬浮在灭菌dd H2O或TE缓冲液中，放4℃待DNA沉淀溶解，过夜 13 次日，配制1%琼脂糖凝胶；每个样品相对应地在PE手套上点上6×loading buffer约1μl，每个样上样5μl，与6×loading buffer 混匀后，点湿样（可在电泳槽中将凝胶加样孔端没入电解液中，使加样孔中浸满电解液，再将混匀的样品加入点样孔。也可按上述操作在电泳槽外完成点样），1%琼脂糖凝胶电泳（小电泳槽：120V，18-20min；大电泳槽：150V，20min）。 14 EB染色15-25min，清水漂洗，照相。 15 根据照相结果保留提取成功的DNA样品并记录。