核酸序列分析 生物芯片技术.ppt

基因芯片原位合成原理示意图 图2 原位合成原理图 分子诊断学（第2版） * B、合成点样 由具有多个微细加样孔的阵列复制器或阵列器及由电脑控制的机器人来完成。 机器人准确、快速地将不同探针样品定量(0.25～1.0μl)点样于预处理好的基板相应位置上，在基板上产生直径为100～150μm斑点，再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。 * （二）样品的制备及标记 样品的制备：提取、纯化，也可对样品进行适当程度的扩增，以提高阅读灵敏度。 待测样品的标记：大多采用Cy3、Cy5进行单色或双色荧光标记，对于阵列密度较小的基因芯片可以用同位素（如33P）标记。 * （三）样品与基因芯片的杂交 cDNA基因芯片与靶基因的杂交过程与常规的分子杂交过程基本相同，相当于一种反相斑点杂交。 用于检测基因表达，需要在低温、高盐浓度下进行较长时间的反应 。 用于突变检测，需要在高温、低盐浓度下进行较短时间的反应 。 * （四）杂交结果的检测及分析 检测方法很多，如荧光显影法、质谱法、化学发光和光导纤维等，使用最广泛的是荧光显影法。 荧光检测器主要有激光共聚焦显微扫描系统和高性能的电荷偶联照相机(CCD) 。 * 芯片 激光光源 电子束分裂器 聚焦小孔 检测器 滤光镜 聚光镜 物镜 图5 荧光显影法 * * 基因芯片的数据分析 基因芯片的数据分析，就是把原始数据按一定标准精简、归类，然后从归类数据中寻找有实际生物学意义的过程。 合理选择数据分析方法，是充分发挥基因芯片功能的必要条件。 * 芯片数据分析的步骤 ① 标准化，也称归一化，用来消除不同芯片、不同标记物之间的差异； ②数据精简，在大量的芯片数据中去掉那些不能提供一个显要意义的信息数据； ③统计学分析，利用聚类法或分类法等对所得到的芯片数据进行分析归类，对分类结果进行进一步的统计学检验，以保证其准确性； ④生物学意义分析，在统计学分析结果的基础上，对其所代表的生物学意义进行研究，以得到相应的结论。 * （五）基因芯片的应用 定量分析（主要指测序和突变检测） 定性分析（主要指对基因表达的研究） * 图6 基因芯片的用途 分子诊断学（第2版） * （五）基因芯片的应用 基因表达水平的检测 DNA序列测定 基因突变和多态性的检测 基因芯片在疾病诊断中的应用 基因芯片在药物研究中的应用 * 二、蛋白质芯片 蛋白质芯片又称蛋白质微阵列，是指固定于支持介质上的多肽或蛋白质构成的微阵列。 蛋白质芯片技术是一种快捷、高效、并行、高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术。 蛋白质芯片适用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA、蛋白质-小分子物质间相互作用的分析。 * 蛋白质芯片的原理 支持物表面高度密集排列探针蛋白点阵（探针蛋白可选用抗体、抗原、受体、酶等具有生物活性的蛋白质，单抗是较好的探针蛋白），测定时，探针蛋白特异性地捕获样品中的靶蛋白，然后通过检测系统对靶蛋白进行定性及定量分析。 * 蛋白质芯片的应用 疾病诊断与疗效判定 新药的研制与开发 蛋白质研究方面的应用 进行高灵敏的蛋白表达分析和抗原-抗体及配体-受体特异性筛选； 生物分子的识别与检测，及时地观察生物分子之间的相互作用； 酶底物的识别与检测，揭示酶与底物的作用过程； 进行蛋白样品的分离及分析； 研究蛋白质和小分子物质的相互作用。 * 分子诊断学（第2版） 图5 焦磷酸测序技术原理 * Pyrosequencing 图1. 454测序技术流程 454技术的主要缺点是无法准确测量同聚物(homopolymer)的长度。例如当待测序列中出现Poly(A)的情况下，测序反应中会一次加上多个T，而加入T的数目只能从荧光信号的强度来推测，有可能造成结果不准确。也正是因为这个原因，454技术主要的错误不是来自核苷酸的替换，而是来自插入或缺失。 454技术最大的优势在于较长的读取长度，使得后继的序列拼接工作更加高效、准确。 （2）Illumina公司的Solexa技术 ①?待测DNA文库的构建把待测序列打断成200-500?bp的小片段，并在小片段两端加上不同的接头，连接载体，构建ssDNA文库。 ②Bridge?PCR：DNA与流动槽的附着将这些ssDNA随机地附着在流动槽表面的channel上。流动槽是一种含有8个channel的微纤维板，它的表面固定有很多接头，能支持ssDNA在其表面以固定的接头为模板进行桥式扩增。 * 测序：边合成边测序（SBS） 向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP。由于这些dNTP的3′羟基被化学方法保护，因而每轮合成反应都只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱。加入激发荧光