微透析技术与方法-研究生.pptVIP

* * 微透析技术与方法 洪 宗 元 皖南医学院定量药理研究所 微透析技术是一种微量化学采样与检测技术 微透析技术 微透析系统组成 微透析技术原理 微透析技术特点 透析相关仪器及透析液 微透析实验操作 微透析实验的注意事项 一、微透析系统组成 Perfusion medium: aCSF Flow rate: 2 ?l/min Dialysis probe Area of diffusion Freely moving rats ① ② ③ ④ 二、微透析技术原理 微透析探头是由具有一定截留分子量的纤维半透膜制成(microdialysis probe，MDP)； 将探头埋入待测的组织区域，以恒定速度向探头内灌注与组织液成分相近的等渗灌流液； 当灌流液流经探头前端透析膜时，组织内小分子量生物活性物质即顺浓度梯度从膜外扩散入膜内，并随灌流液被引流至探头外； 按一定的时间间隔连续收集透析液，检测其中待测生物活性物质水平，可监测该区域内细胞外生物活性物质浓度的经时变化过程 微透析技术原理优点 组织损伤小、取样少、方便、快捷、可连续监测且易实现自动化等优点。 微透析系统示意图-Anesthesized rats Anesthesized rats 微透析系统示意图- Freely moving rats Perfusion medium: aCSF Flow rate: 2 ?l/min Dialysis probe Area of diffusion Freely moving rats ① ② ③ ④ MDP：常用管式半透膜与不锈钢、石英或塑料毛细管构成，半透膜由再生纤维素、聚碳酸脂或聚丙烯腈制成。截留分子量 5,000-100,000 dolton不等。适合神经递质等小分子物质通透，而蛋白质难以通透 ； 三、微透析技术特点 ? 灌流液：脑微透析的灌流液一般采用人工脑脊液 (artificial cerebral spinal fluid, aCSF)、Ringer或 Krebs 溶液； ? 检测方法： ? 微透析技术特点(续） --单胺类物质测定主要采用高效液相色谱 (HPLC-ECD 法； --氨基酸类物质多用 HPLC-荧光法测定； --乙酰胆碱、乳酸、抗坏血酸、丙酮酸和嘌呤类等物质多采用 HPLC-紫外检测法； --神经肽类物质主要用放射免疫法测定。 （一）微透析探针 组成成分：小口径的透析膜、硅管、防水万用胶、硅胶毛细管 1.橡胶管； 2.硅胶管（silica tubing）粗管； 3.硅胶管（silica tubing）细管； 4.聚乙烯管(PE-10 (polyethylene tubing)； 5.透析膜（Dialysis membrane）； 6.环氧乙烷（epoxy adhesive）； 7.注射针头。 四、透析相关仪器及透析液 （二）透析泵 1.流速稳定且缓慢，介于 1-5μl/min 2.快速的前进/后退模式，连续而可调整的流速，和微调控制选择（microprocessor control option） 3.液体转动轴（liquid swivel）:动物可自由行动，不会被透析管缠住 4.常用透析泵 CMA/100, Harvard Microliter , Sage Model 341A （三）透析液转换器 Carnegie Medicine 公司发展了一个全自动的透析液转换器 CMA/110 及 CMA/111。因这个机器有微调的功能，马达驱动的设备，来转换透析液，在转换过程中不会让空气进入。 （四）透析液收集 1.手动收集透析液 虽然耗时间，但可使一台 HPLC 发挥最大功用。例如收集时间要 20 分钟，测定一个样品只要 7-8 分钟，则一台 HPLC 力足以应付 3 种样品；使样品分离和分析很明确 2.自动收集器 (CMA/140) 按一定间间隔将透析液收集在冷藏（refrigerated）设备的旋转盘上的玻璃小瓶内,这就不需在实验过程中一直看守着仪器。但就无法一边收一边分析透析液 3.在线收集与检测 (Online) 将探针出口直接连到 HPLC 的承载阀（load-valve）上，而直接在线上自动分析透析液。即把一台 HPLC 限制在单一动物身上，使透析实验全自动化 （五）灌流液 (perfusate) 1. Ringers solution： ? 140 mM NaCl ? 3.0 mM KCl ? 1.2-3.4 mM CaCl2 ? 1.0 mM MgCl2 ? 1.2 mM Na2HPO4 ? 0.27 mM NaH2PO4 ? 7.2 mM glucos