第8章体外放射分析技术新版.ppt

体外放射分析技术 定义：指以放射性核素标记的配体作为示踪剂，以配体和结合体的特异性结合反应为基础，以放射性测量为定量依据，在体外实验条件下，对超微量物质进行定量检测的一类测量技术的总称。 特点：灵敏度高、特异性强、操作简便、应用范围广。 分类： 1、竞争性体外放射分析法，如：RIA、CPBA、 RRA 等 基本原理相同，不同点是配体和结合体的种类不同。 2、非竞争性体外放射分析法，如：IRMA等。 3、由体外放射分析技术派生出来的非放射性标记免疫分析技术 如：酶标记的免疫分析法、化学发光免疫分析法等。 重点： RIA、 IRMA .1 放射免疫分析技术 （radioimmunoassay，RIA） 发现与应用 1956年美国科学家Yalow和Berson成功地建立放射免疫分析这一超微量物质的测定技术，开创了生物活性物质超微量测定的新纪元，该技术目前已深入应用到基础医学（如分子生物学、生物化学、免疫学、药理学、 毒理学、微生物学、寄生虫学）和临床医学（如内分泌学、妇产科学、儿科学、肿瘤学、血液学）等学科的不同领域中, 对于推动基础医学和 临床医学的发展作出了重大贡献，并于1977荣获诺贝尔生物医学奖。 放射免疫分析技术及特点？ 指以放射性核素标记的抗原作为示踪剂，以抗原和抗体的特异性结合反应为基础，以放射性测量为定量依据，在体外实验条件下，对超微量物质进行定量检测的一种测量技术。 体外放射分析的特点： 灵敏度高 特异性强 准确度高 稳定性好 应用范围广 蛋白质、多肽、甾体类激素及 具有生物活性的小分子物质的 检测等，如:血药浓度测定。 放射免疫分析的基本原理 一定量的标记抗原与非标记抗原与有限量的特异抗体发生 可逆性的竞争结合反应，反应平衡后分离出抗原抗体复合物， 通过测量放射性复合物量来计算出非标记抗原量。 由于*Ag与Ag免疫化学性质一样，对抗体都有相同的结合能力，在Ab的量有限时，这种结合就出现相互竞争，彼此抑制，因此也把RIA的原理称为竞争性抑制反应. 分析过程 标准曲线绘制：用一系列浓度已知的标准抗原,在严格相同的条件下与一定量的*Ag和有限量的Ab共同反应，反应达到平衡后，分离B与F，测定B的放射性，以每一反应管的标准品浓度为横坐标，以B的放射性计数（CPM）或结合率（B/F、B/T、F/T）作为纵坐标绘制标准曲线。 待测物的浓度测定：根据被测抗原试管中的B的CPM值或结合率，在标准曲线上求出待测抗原的浓度。 标准曲线的性质 放射免疫分析如上所得的标准曲线是一条曲线而不是直线，因为其结合反应中的变量之间的函数关系式： Ab0、 Ag0抗原抗体的初始浓度，B为每个反应体系达到平衡时*Ag结合的百分率，可见为一元二次方程式，所以放射免疫分析的剂量反应关系为双曲线，也可用不同的反应参数（ F或R ）进行推 导，均为一元二次方程，说明待测抗原与反应参数间均为曲线关系。 放射免疫分析总体条件 抗原的的量一定，而Ab的量限定； *Ag与Ag的免疫学性质相同； 定量准确的标准品； 高比活度的标记品； 高亲和力的抗体； 合适的分离技术； 理想的曲线拟合方式。 放射免疫分析基本试剂与要求 1.标准品 标准品是呈一定的浓度梯度且准确定量的一组未标记的抗原。用作绘制标准曲线，是待测样品定量的基准和标准曲线绘制的依据，因此一个好的标准品要满足以下几点要求： ① 与待测物的应属于同一种物质（分子结构、构 型、抗原决定簇及亲和力等均相同，如HCG)； ② 高度纯化，不含影响分析的干扰物； ③ 定量准确 。 2.标记品（*Ag） 常用于标记的放射性核素主要有125I、3H、14C等，其中又以125I应用最多、最广泛，标记品是放免的测量依据，一个好的标记品对测量结果的准确度及灵敏度等具有极其重要的意义，一个好的标记品一般有如下要求： ①高比活性和放化纯度（＞95%）； ②与标记前的生物活性及免疫活性要一致； ③标记的放射性核素T1/2要适宜； ④稳定性高 。 3. 特异抗体 抗体制备：抗原（＞5000）直接免疫动物→