生物化学--实验十一血清谷—丙转氨酶活性的测定（改良赖氏法）.docVIP

实验十一 血清谷—丙转氨酶活性的测定（改良赖氏法） 【目的要求】 1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。 3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。 【实验原理】 血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸： COOHCH COOH CH2 CH2 H2N－C－H COOH COOH CH2 CH2 C=O COOH CH3C=OCOOHCH CH3 C=O COOH CH3 H2N－C－H COOH ALT+ ALT + 37℃、pH7.4+ 37℃、pH7.4 + a-丙酮酸L-谷氨酸L- a-丙酮酸 L-谷氨酸 L-丙氨酸 a-酮戊二酸 α-酮酸RC=OCOOH+HH α-酮酸 R C=O COOH + H H2N—N— NO2 —NO2 2,4二硝基苯肼 丙酮酸二硝基苯腙(黄色) CH3 H C=N—N— COOH NO2 —NO2 H2O H H2O 苯腙硝醌化合物(红棕色) CH3 C=N—N= COOH NO2 =N—O O- OH- 尽管基质液中余下的a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝醌化合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对505nm的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，结果比其他比色法准确。故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续监测法的单位使用赖氏法。1981年全国常规生化检验方法学术讨论会认为赖氏法测定ALT活性较为合理，全国肝炎协作会议也建议统一使用改良赖氏法。 【实验准备】 一、器材 1.5×15cm试管、刻度吸量管。 2.恒温水浴、离心机、721型分光光度计。 二、试剂 1.0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液 ⑴0.1mol/L磷酸氢二钠溶液：称取Na2HPO414.22g或Na2HPO4·2H2O17.8g溶解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml,4℃保存。 ⑵0.1mol/L磷酸二氢钾溶液：称KH2PO413.61g溶解dH2O2中，稀释至1 000ml,4℃保存。 ⑶将0.1mol/L磷酸氢二钠溶液420ml和0.1mol/L磷酸二氢钾溶液80ml,混匀，即为0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴，4℃保存。 2. 标准丙酮酸（含丙酮酸2.0μmol/ml） 取标准丙酮酸钠10mg，用上述缓冲液准确定容为50ml。此液须当日用当日配。 3. ALT底物液（含α-酮戊二酸2μmol/ml及DL-丙氨酸200μmol/ml） 取α-酮戊二酸29.2mg，DL-丙氨酸7g ,用试剂1溶成100ml，在稀释到刻度前，以1mol /L NaOH调pH至7.4（因为转氨酶在pH7.3以下或7.6以上的环境中酶活性下降），加数滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用4天。 4. 2.4二硝基苯肼溶液 取分析纯2,4二硝基苯肼19.8mg，用1mol /L HCl溶于100ml，置棕色瓶中保存。 5. 0.4mol/L NaOH溶液 常规配制。 【实验操作】 1.取空腹静脉血2ml，经离心分离得到血清，保存于冰箱中待用，因为血细胞中转氨酶活性较血清中高，故应防止溶血。若血清中此酶活性过高，则可适当稀释后再用。 2.取干净试管12支，按下表所示标号，要求各S管和U管进行双管平行操作。先做对照管和测定管，在30min保温期间再做空白管和标准管。 赖氏法测ALT的标准曲线的绘制及活性测试实验操作、记录表 记录实验数据和 管 实验现象 号 操作程序与条件 空白管 (0) 标准管(S) 对照管(B) 测定管(U) 0 S1,S1’ S2,S2’ S3,S3’ S4,S4’ B U1, U 2 ⑴血清(ml)37℃预孵5min后用 0.1 0.1 ⑵基质液(ml)同上预孵后用 - 0.5 ★混匀各B、U管，置37℃恒温水浴中,准确保温30min，其间完成0→S4’管的加液工作 ⑶缓冲液(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 - - ⑷标准丙酮酸(ml) - 0.05 0.10 0.15 0.20 - - ⑸基质液(ml) 0.5 0.45 0.40 0.35 0.3 0.5 - ⑹2,4二硝基苯肼(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 ★混匀各管，置37℃水浴中保温20min ⑺0.4molNaOH(ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 ★混匀各管，于5min后,30min内以721型分光光度计比色，波长505nm，空白管调零点，分别读取各管吸光度。 各管