长期定位施肥对石灰紫色土真菌特性影响.ppt

数据处理 * 四川农业大学◎ 硕士学位论文答辩 姓 名：李 芳 指导老师：张小平 教授 专 业：土 壤 学 主 要 内 容 选题背景及依据 1 研究目的意义及技术路线 2 材料与方法 3 结果与分析 4 致 谢 5 第一部分 选题背景及依据 是影响土壤质量及其可持续利用最深刻的农业措施之一，会对土壤结构、生物肥力和生产力产生重要影响。 我国一种特有的土壤资源，分布面积广泛。可分为酸性紫色土、中性紫色土和钙质紫色土。 分解植物残体，释放维持植物生长的营养。促进植物生长，防御植物病害等，也可造成植物病害。 紫色土 施肥 真菌 前人 土壤理化 性质，作 物产量 生物学 角度 ？ 表型分析 分子足迹 多样性 群落结构 动态变化 选题背景及依据 第二部分 研究目的意义及技术路线 利用表型分析和“分子足迹”技术研究不同施肥制度对石灰性紫色土相关真菌特性和土壤活性的影响，可以为在该类土壤上建立长效合理施肥制度，保护土壤真菌，维持土壤质量提供理论依据。 本试验通过采集遂宁长期定位施肥试验田内的土壤，通过传统的实验室培养方法和现代分子生物学方法的有机结合，旨在研究在不同施肥方式和不同作物种类下石灰性紫色土真菌生物量和群落结构的多样性，为长期定位施肥下石灰性紫色土中真菌对土壤质量方面的影响提供科学依据。 研究目的、意义 创新点 第二部分 研究目的意义及技术路线 技术路线 土样采集 样品处理 富集培养 长期定位施肥对石灰性紫色土 真菌特性的影响 群落结构分析 分离计数分类 生物量测定 群落结构分析 侵染率测定 孢子分离鉴定 理 化 性 质 分 析 真 菌 分 析 A M F 分 析 第三部分 材料与方法 丛枝菌根真菌（AMF）培养鉴定方法 丛枝菌根真菌（AMF）侵染率测定方法 真菌和AMF群落结构PCR-DGGE测定方法 真菌数量及生物量测定方法 土壤理化性质分析 研究区概况和土样采集 第三部分 材料与方法 农肥, N,P,K 农肥 N,P 农肥(M),N 农肥(M) N,P,K N,P N 无肥 8 7 6 5 4 3 2 1 整个试验小区之间用水泥板隔开，留有排水沟。 名称：氮、磷、钾长期定位肥料试验 面积：总面积：2亩，小区面积：0.2亩。 土壤类型：原生钙质紫色土 试验开始时间：1982年。 研究区域概况 施肥处理 轮作方式：水稻-小麦。 采集于四川省遂宁市船山区的 石灰性紫色土壤 采样时间 2009.5 小麦收割后 2009.10 水稻收割后 采样方法 梅花形采样法 一部分样品立即用于VA菌根的富集培样 一部分放于室内风干，用于土壤基础理化性质的分析 另一部分新鲜土壤研磨过筛后，装入无菌袋中，置于4℃冰箱保存，以供可培养真菌分离与计数，生物量分析和群落结构分析 土样采集 第三部分 材料与方法 采用常规 分析方法 土壤理化 性质的测定 pH，有机质， 全氮，碱解氮， 全磷，速效磷， 速效钾 真菌数量 分析 AMF多样 性分析 培养基 马丁氏培养基 分离与计数 平板稀释法 分类 真菌鉴定手册 真菌生物量 分析 高效液相色谱 测定土壤中 麦角甾醇来反 映其生物量 真菌细胞膜双层结构的重要组成成分 加富培养 孢子分离 改进的湿筛-蔗 糖梯度离心法 种的鉴定 VA菌根真菌 鉴定手册 侵染率测定 KOH-透明法 第三部分 材料与方法 试 验 方 法 采用Fast DNA SPIN Kit For Soil(Bio- Rad Co.)的试剂盒方法微生物总DNA的提取 PCR产物的变 性梯度凝胶电泳 (DGGE)分析 18SrDNA 的PCR扩 增 土壤总 DNA提取 真菌18S rDNA的PCR扩增 PCR反应程序参考Smit的方法 AMF18S rDNA的PCR扩增 采用Nested-PCR程序 用第三次PCR纯化产物进行DGGE，采用变性梯度为20％～50％的8％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，然后采用银染法对凝胶进行染色。DGGE指纹图谱分析借助于Bio-Rad公司的凝胶成像系统进行条带判读、迁移率、强度计算及聚类分析。 土壤真菌和AMF群落结构的PCR-DGGE方法 第三部分 材料与方法 Shannon-Wiener指数(H) EH=H/Hmax=H/lnS Pi为某一条带的强度与同泳道中所有条带 总强度的比值，S为每一泳道总的条带数。 真菌计数：每克干土中菌数 = 菌落平均数 × 稀释倍数/干土%。 种的丰度：SR=AM真菌总种次数/土壤样本