酵母双杂交筛选PAK4相互作用蛋白质及PAK4与LZW2相互作用的验证.pdfVIP

相互作用的验证 目的 肿瘤是世界范围内人类疾病，而乳腺癌作为女性最常见的恶性肿瘤之一，其 发病率近年来持续上升，而且乳腺癌的转移和复发常常是患者最常见的死亡原因。 因此，对于乳腺癌的发病机制及治疗研究成为我国目前对其研究的一个重要课题。 kinasc P21活化激酶(P21．activatedP：AK)是一类进化上保守的丝氨酸／苏氨酸 参与许多重要细胞活动。到目前为止PAK家族共有6个成员，皆含有氨基末端(N． 末端)调节区和羧基末端(C．末端)激酶区。根据其结构相似性。将它们分为两 在结构、活化方式、生物学功能上有着很大的区别，它们具有不同的下游靶蛋白。 PAK4定位于19号染色体，是目前研究最广泛的II类PAK，其在许多生物学活动 如细胞骨架重排、细胞迁移、细胞凋亡中发挥重要作用。鉴于PAK4在细胞内信 号转导通路中的重要作用，本实验利用酵母双杂交技术从人胎脑eDNA文库中筛 选出了若干个PAK4新的相互作用蛋白，并选取了一个较为感兴趣的蛋白LZW2， 验证二者在体内外的相互作用，并验证LZW2与ESCRT-III复合体成员的互作。 LZW2为USP(ubiquitin．specificprotease)蛋白家族成员之一，此家族是一类 进化保守的去泛素化酶家族，入源USP共包括56个成员。USPs通过能去除其靶 基因上的泛素化链而参与到细胞信号网络的调节并作为肿瘤抑制子或癌基因发挥 作用。但目前对LZW2的研究却几乎完全空白。 万方数据 损伤。这一研究加深了我们对细胞分裂过程的理解，并可能为癌症研究提供新的 途径。 本课题利用酵母双杂交的方法，从人胎脑eDNA文库中筛选PAK4相互作用 蛋白。LZW2的发现为PAK4肿瘤信号通路的迸一步完善提供了新的依据，本课 成员的互作，为探究LZW2在细胞分裂中的作用提供了方向，为将来探讨其生物 学功能奠定基础。 实验材料与方法 一、实验材料 (一)基因克隆相关分子生物学试剂 (二)酵母双杂交和酵母蛋白、质粒提取相关试剂 二、实验方法 鉴定 (二)在AHl09酵母菌株中验证融合蛋白的表达 (三)顺序转染法筛选PAK4相互作用蛋白 (四)对阳性克隆进行测序 (五)分析阳性克隆的测序结果 (六)构建外源性高表达LZW2的重组质粒 (七)探测乳腺癌细胞系中LZW2的表达情况 (八)GST-Pull Down实验验证PAK4及其家族成员与LZW2相 互结合 C印旧2B在体内相互作用 结果 2 万方数据 白质，利用酵母杂交方法筛选出了两个与PAK4蛋白质互作的Ade+／His+／LacZ+ 阳性转化子，在NCBI上检索得到了P50和LZW2等蛋白质。 我们选取较为感兴趣的LZW2蛋白，利用GST-PullDown实验验证了PAK4 及其家族成员与LZW2相互结合，并引入ESCRT-III复合体，免疫共沉淀验证 LZW2与CHMP2A和CHM2B在体内相互作用。 结论 利用酵母双杂交筛选了两个与PAK4相互作用的蛋白质。选取较为感兴趣的 LZW2蛋白，利用GST-Pull Down验证了两者的相互作用，并引入ESCRT-I／I复合 体，免疫共沉淀验证LZW2与CHMP2A和CHMP2B在体内相互作用。 关键词 PAK4，酵母双杂交，LZW2，ESCRT-I