阳性对照本文方法裂解液硅胶柱玻璃珠硅胶柱苯酚抽提乙醇沉淀.ppt

* * Journal of immunological method A method for isolating and analyzing human mRNA from newborn stool 2009，V349 2011,08,24 徐振杰 1. Introduction 1. 人类转录组对于人类健康和疾病的研究很有价值； 2. 目前的研究仅限于血液、尿液和软组织； 3. 对于粪便等中的转录子的研究也仅限于成人消化道肿瘤的检测； 4. 目前用于分离人类粪便RNA的方法和试剂未能商业化或者未能去除PCR抑制因子。 本研究发展了Kang的方法，报道了样品间和个体间的mRNA的差异。 2. Materials and Methods 三个婴儿，分别是怀孕27周、27周、29周出生的婴儿，收集其新鲜粪便。三步法提取RNA:玻璃珠法+苯酚-氯仿抽提+硅胶柱纯化。 阳性对照组：成人血液白细胞和E.coli，用试剂盒方法提取总RNA。 总RNA得率：分光光度法，表示为RNA的质量/粪便样品的质量；RNA完整性（RIN）用Agilent 5200 Bioanalyzer分析。 逆转录定量PCR：分别用引物扩增IL-6，IL-8，S100A8（钙网蛋白的一个亚基），EGF(表皮生长因子)和GAPDH（管家基因，用于内参）。 PCR抑制因子的检测：用本文方法及其他三种方法提取新生儿粪便中的RNA，以人的白细胞总RNA 或E.coli总RNA为阳性对照，分别用β-肌动蛋白和16S rRNA基因引物PCR扩增，电泳检测。 2. Materials and Methods 3. Results 3.1 RNA的获得与定量 RNA浓度（RNA质量与粪便质量的比值）较高，完整性较好，RIN达8.6； 比较了4℃和-20℃下储存的样品在0~24h的总RNA得率，显示冷冻4h以内提取最好。 Figure 1 3.2 样品间的差异 以GAPDH做内参，比较了同一样品的三个等份之间的RNA相对产率，结果发现几乎无明显差异，说明该法重复性好。 3. Results Figure 2 3. Results 3.3 不同个体之间以及同一个体不同时间之间的差异 以GAPDH做内参，比较了不同个体之间以及同一个体不同时间之间的RNA相对产率，结果发现差异显著。 Figure 3 3. Results 比较了三个个体在不同时间GAPDH 的含量。结果显示不同时间之间差异显著。 Figure 4 3. Results 3.4 PCR抑制因子 分别用β-肌动蛋白和16S rRNA基因引物PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳。 阳性对照 本文方法 裂解液+ 硅胶柱 玻璃珠+ 硅胶柱 苯酚抽提+乙醇沉淀 Figure 5 4. Discussion 1. 尽管患者体内菌群数量也是一个引起变化的重要来源，但是GAPDH随着时间和个体的变化，仍可以作为上皮细胞或炎症细胞在患者体内变化的替代指标。 2. 样品收集后在室温或者4℃放置4 h对于获得完整的RNA是很重要的，可能是由于存在潜伏期。 3. 本研究所选取的几个指标：GAPDH，EGF，IL-6，IL-8，S100A8。 *