蚯蚓纤维蛋白溶解酶的提取分离纯化.pptVIP

蚯蚓纤维蛋白溶解酶的提取分离纯化 生物062 第二组 酶是植物体内具有催化作用的蛋白质，动植物体内的生化反应，一般都是在酶的作用下进行的，没有酶的催化反应，动植物的生命也就停止了，因此对酶的研究是阐明生命现象本质中十分重要的部分。为要研究酶首先要将酶从组织中提取出来，加以分离、纯化，不同的研究目的对酶制剂的纯度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制剂即可，而有些工作则要求较纯的酶制剂，需根据不同情况区别对待。在酶的提取和纯化过程中，自始至终都需要测定酶的活性，通过酶活性的测定以监测酶的去向。  酶的存在位置？ 存在于动植物以及微生物的细胞的各个部位 什么是酶的提取与分离纯化？ 酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所需要的酶制品的过程。 酶的粗提液是否只有酶，有没有其它物质？ 除含有所需要的酶外，还含有其他蛋白质，以及其他大分子和小分子化合物杂质。因此需要根据提取酶与杂质的性质差别进行分离纯化。 如何将酶从粗提液中分离纯化？ 要在许多蛋白质的混合物中分离出所需要的酶蛋白，目前常用的方法有盐析法（利用不同蛋白质在不同盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离），柱层析法，薄膜超滤法，亲和层析法，电泳法等。在大体积的提取液中一般先采用硫酸铵分级盐析沉淀。盐析法是提纯酶使用最早的方法之一，迄今仍广泛使用，而且在高浓度的盐溶液中酶蛋白不易变性而失去活性，利于工作在室温中进行。不同蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度有不同程度的降低，盐析法就是利用这一性质，将不同性质的蛋白质分离，选择合适饱和度的硫酸铵，使沉淀的蛋白质的酶活性最大。 沉淀的蛋白质经离心后收集之，再溶于少量缓冲溶液中，经透析或凝胶柱过滤，以除去硫酸铵及其他小分子杂质，然后再经过柱层析分离。由于吸附剂的不同，又有吸附柱层析、离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析等。对于不同的支持物采用的洗脱方法也不同，分子筛类型凝胶过滤柱层析，洗脱液只要用一定浓度的缓冲液就可以了，亦即等浓度洗脱。对于吸附柱和离子交换柱层析，往往要采用浓度梯度溶液进行洗脱，最方便的是线性梯度浓度，当然用非线性梯度会得到更好的分离效果。柱层析一般都需要自动收集仪，如果能配用蛋白质检测仪就更好了。目前柱层析和硫酸铵分级沉淀一样，已经成为一种常规的酶的分离提纯的步骤之一了 近年来纯化酶常用的一种有效方法为亲和层析。主要利用酶和底物、抑制剂或辅酶具有一定的结合能力，这一性质即可用来分离、提纯酶。首先选择一支持物，如琼脂（Sepharose）将底物、竞争性抑制剂或辅酶，以共价键的形式连接到支持物上，然后把含有酶的溶液，流过装有专一性底物、竞争抑制剂或辅酶的层析柱，酶即被保留在支持物上，再经过充分洗涤除去未被吸附的杂质，然后用含有一定浓度的底物或竞争性抑制剂或辅酶的缓冲液，进行竞争性洗脱。如果亲和剂选择合适，往往能得到较高纯度的酶，是酶分离、纯化中既方便又最有效的一种方法。 蚯蚓, 俗称地龙, 在我国入药已有几千年的历史。地龙为环节动物门钜蚓科动物参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓或栉肓毛蚓的干燥体。前一种习称“广地龙”,后三种习称“泸地龙”,主产于广西、广东、福建。性寒,味咸。清热定惊,通络、平喘,利尿;用于高热神昏惊痫抽搐,关节麻痹,肢体麻木,半身不遂,肺热喘咳,尿少水肿,高血压症。地龙是我国重要的中药材之一。最早的中药学专著《神农本草经》中收载的6 7种动物药中就有蚯蚓。李时珍著《本草纲目》虫部4 2卷中用蚯蚓入药的处方有4 0多种。  蚯蚓中含有蚯蚓素, 酶, 维生素等多种营养成分, 具降压平喘, 解热, 利尿通络, 抗过敏, 解毒生肌,溶栓纤维及抗凝血等药理作用。自1983年日本宫崎医科大学美源恒极道、从蚯蚓中提取了具有较高活性的纤溶酶以来, 国内外纷纷研究此酶, 大量实验证明, 该药在动物实验中口服及注射均有抗栓溶栓作用。 蚯蚓构造图 蚯蚓纤维蛋白溶解酶的提取 将蚯蚓放在水组织捣碎机捣碎匀浆, 放入离心机进行离心, 取出上清液, 加人丙酮产生沉淀, 再加人乙醚脱水, 即得粗品。 纤溶酶活检测方法 采用纤维蛋白法侧纤溶活性, 制板按Astrup法。以尿激酶为标准蛋白, 以直径为5mm滤纸片为样品载体, 点样6ul,35 ℃ 一37℃度保存, 测溶圈面积, 以不同单位尿激酶的溶圈面积, 以不同单位尿激酶的溶圈面积与单位作标准曲线（ul一mm）计算样品酶活。 蛋白质纯度的检