中山大学生科院课件-Western Blotting.pptVIP

Western Blotting 蛋白质的分析 实验目的 了解Western blotting的原理及其意义，掌握Western blotting的操作方法。 应用Western blotting 技术分析鉴定经SDS分离后转移到固相膜上的重组蛋白。 WHY 实验原理 蛋白质样品经 SDS电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如尼龙膜、硝酸纤维素膜、PVDF膜）上，以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体和酶标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中培育，显出谱带，即可检测出样品中的特异组分。 抗体 第一抗体：鼠源抗体，针对目标蛋白上的6xHis标签 第二抗体：AP标记的抗鼠IgG（广谱抗体） 操作方法 〈一〉电转移 1．将蛋白质样品进行SDS，待溴酚蓝跑出胶后停止电泳。 2．戴手套切2－4张定性滤纸和一张PVDF膜，它们的大小应与凝胶（去除浓缩胶）的大小相同。在膜的一（左）角作一记号（或剪角），与滤纸和海绵（纤维）垫浸泡于转移缓冲液中。 3． 先将PVDF膜浸泡在100%甲醇中，再浸泡于转移缓冲液中10分钟； 4. 剥胶，并将凝胶裁成合适大小，切角以做记号。 “夹心饼”的制作（1） 4. 次序：负极（黑孔板）－ 纤维垫-1－2张滤纸-凝胶-PVDF膜-1-2张滤纸-纤维垫-正极板（白孔板）－扣上