抗酸染色 厌氧菌培养.ppt

抗酸染色 Structure of an Acid-Fast Cell Wall In addition to peptidoglycan, the acid-fast cell wall of Mycobacterium contains a large amount of glycolipids, especially mycolic acids. The peptidoglycan layer is linked to arabinogalactan which is then linked to high-molecular weight mycolic acids. The arabinogalactan/mycolic acid layer is overlaid with a layer of polypeptides and mycolic acids consisting of free lipids, glycolipids, and peptidoglycolipids. Other glycolipids include lipoarabinomannan and phosphatidyinositol mannosides (PIM). 实验材料： 细菌：结核杆菌 染液：石炭酸复红液、3%盐酸酒精、碱性美兰溶液 实验方法： 1、细菌涂片标本的制备 涂片，干燥，固定 2、染 色 1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗。 2）脱色： 3%盐酸酒精脱色30秒至1分钟；脱色时轻轻摇晃玻片，直至涂片无色脱出或稍呈粉红色时为止；用水冲洗。 3）复染：用碱性美兰溶液复染1分钟，用水冲洗后用吸水纸吸干。 3、油镜观察 实验结果： 结核杆菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝状生长。背景及非抗酸性细菌呈兰色。 注意 抗酸染色直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，以提高检出率。染厚涂片时，须掌握复染色时间。如果背景过深，影响镜检。 结核杆菌菌体一般比较细长,如果是短杆菌,有可能不是结核菌,可能是脱色时没有脱完全,一般要脱到红色背景消失为止,否则非抗酸菌也可能染成红色而造成误判。 结核杆菌的培养特点 培养基：罗-琴氏（Lowenatein Jensen）培养基 主要成分：蛋黄；甘油；天门冬素；马铃薯淀粉；无机盐；孔雀绿； 蛋黄含脂质生长因子，能刺激生长，孔雀绿可抑制杂菌生长。 揶花菜状菌落 生长特点： 左：固体培养基上生长缓慢；2-4周可见菌落，粗糙型颗粒状，结节状，菜花状；呈乳白色或米黄色，不透明。 右：在液体培养基中可能由于接触营养面大，细菌生长较为迅速。一般1～2周即可生长，呈膜样生长。 麻风杆菌的形态及培养 与结核分枝杆菌相似。细长、略带弯曲，常呈束状排列。革兰和抗酸染色均为阳性。经治疗后可呈短杆状、颗粒状或念珠状多形性，可能是L型变异。未经彻底治愈可导致复发。 麻风分枝杆菌在体外人工培养至今仍未成功。有人将麻风分枝杆菌注入小鼠足垫，并将足垫温度降低，即可见麻风分枝杆菌繁殖并能传代。 麻风杆菌呈红色，背景及非抗酸性细菌呈兰色。 厌氧菌的培养 厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。 培养方法 疱肉培养基：一个不需特殊设备的厌氧培养法。疱肉和肉汤装入大试管，含不饱和脂肪酸和谷胱甘肽等还原性物质。液面封凡士林，造成无氧环境。 焦性没食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末没食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。焦性没食子酸与碱反应后耗氧。该法用于厌氧不严格的厌氧菌的培养，简单。如有梭状芽孢杆菌。 厌氧缸法接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。 厌氧生物袋是一种特制不透气的塑料袋，袋中装有气体发生管、催化剂小管(钯)和指示剂管(美蓝)。接种好的平板放入袋中，排出袋中气体，卷叠好袋口，用弹簧夹夹紧，然后折断气体发生小管，使发生反应产生CO2、H2等，在催化剂钯的作用下，H2+O2(袋中剩余氧)=H2O，这更保证了无氧环境，经0.5h再折断美蓝液安瓿(美蓝在无氧环境中呈无色美白，在有氧环境中又可变成蓝色的美蓝)，如指示剂不变蓝，表示袋内已成无氧环境，此时即可放37℃孵育培养。 生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物（多是植物），消耗氧气，同时产生