中大细胞教案9B.doc

PAGE 9.2.3粗面内质网的功能—蛋白质转运 粗面内质网的主要功能是帮助膜结合核糖体合成的蛋白质转运。膜结合核糖体上合成的蛋白质与游离核糖体上合成的蛋白质去向是不同的,表9-5列出了这两类核糖体合成的某些蛋白。 表9-5真核细胞中膜结合核糖体和游离核糖体合成的某些蛋白 膜结合核糖体游离核糖体 分泌蛋白可溶性胞质溶胶蛋白 肽类激素脂锚定膜蛋白 生长因子(位于质膜的胞质面) 消化酶类外周蛋白 血清蛋白(质膜的胞质面) 细胞外基质蛋白核基因编码的线粒体蛋白 释放到ER腔中的蛋白核基因编码的叶绿体蛋白 RER中的酶类过氧化物酶体蛋白 高尔基复合体的酶核蛋白 溶酶体的酶 整合膜蛋白 ER膜的糖蛋白 高尔基体的膜糖蛋白 溶酶体膜糖蛋白 质膜糖蛋白 核膜糖蛋白 脂锚定质膜蛋白 质膜的外周蛋白 (位于质膜的外侧面) 由于粗面内质网上合成的蛋白质包括膜蛋白、内膜结构的潴泡腔蛋白和分泌到细胞外的蛋白,所以必须有极好的运输机制进行分选定位,这就是信号肽假说。 ?信号序列的发现和证实 ?微粒体实验 在GeorgePalade用离心技术分离到有核糖体结合的微粒体,即发现膜结合核糖体(membrane-boundedribosome)之后,科学家推测:膜结合核糖体合成的蛋白质首先要进入内质网的腔,然后通过选择性的分泌过程输出到细胞外,而游离核糖体上合成的蛋白质则留在细胞内使用。 为了研究内质网上合成的蛋白质是否进入了内质网的腔,ColvinRedman和DavidSabatini用分离的RER小泡(微粒体)进行无细胞系统的蛋白质合成,证明了膜结合核糖体上合成的蛋白质进入了微粒体的腔。 如何利用利用微粒体在无细胞蛋白质合成系统中的合成实验证明膜结合核糖体合成的蛋白质进入了微粒体的腔。 ?GünterBlobel等的建议 为什么有些核糖体合成蛋白质时不同内质网结合,有些正在合成蛋白质的核糖体要同内质网结合,并将合成的蛋白质插入内质网?对此,美国洛克菲勒大学的GünterBlobel、DavidSabatini和BernhardDobberstein等于1971年提出两点建议: ①分泌蛋白的N-端含有一段特别的信号序列(signalsequence),可将多肽和核糖体引导到ER膜上;②多肽通过ER膜上的水性通道进入ER的腔中,并推测多肽是在合成的同时转移的。 ?信号序列存在的直接证据 1972年,CésarMilstein和他的同事用无细胞系统研究免疫球蛋白(IgG)轻链合成时获得了信号序列存在的直接证据,证明Blobel等的建议是正确的。他们用分离纯化的核糖体在无细胞体系中用编码免疫球蛋白轻链的mRNA指导合成多肽,发现合成的多肽比分泌到细胞外的成熟的免疫球蛋白在N端有一段多出的肽链,它有20个氨基酸,他们推测,这段肽具有信号作用,使IgG得以通过粗面内质网并继而分泌到细胞外。 ?信号序列的进一步证实 G.Blobel、B.Dobberstein、P.Walter和他们的同事在上述发现的基础上用分离的微粒体和无细胞体系进行了大量的实验,进一步证实了信号序列的存在及其作用。 加与不加RER小泡,产物不同当将分泌蛋白的mRNA在无细胞体系中进行翻译时,如果不加粗面内质网(微粒体),获得的翻译产物比从细胞中分泌出来的蛋白要长,若添加RER小泡,翻译的产物长度与从活细胞分泌的蛋白相同。因此推测信号序列在引导蛋白进入内质网后被切除了,所以成熟的蛋白的N-端没有信号序列(图9-16)。 图9-16信号序列在分泌蛋白质运输中的作用 (a)在不含RER小泡的无细胞体系中翻译分泌蛋白,其N-端有信号序列,故比从细胞中分泌出来的相同蛋白质肽链长;(b)在加有RER小泡的无细胞体系中翻译分泌蛋白,信号序列在RER小泡中被切除,得到的产物与从细胞中合成分泌的相同。 蛋白水解酶水解实验在分泌蛋白进行体外翻译的无细胞系统中(含有RER小泡)加入蛋白水解酶,并不能使新生肽水解。但同时加入去垢剂,则能将蛋白质水解,提示新生肽链是边合成边运输的,因为去垢剂能够破坏内质网的膜,使合成的蛋白质暴露于蛋白水解酶遭到降解。若无去垢剂,多肽在合成的同时就向内质网转运,所以不受蛋白水解酶的影响。 多聚核糖体的离体翻译 从骨髓瘤分离多聚核糖体，用去垢剂处理，使之与内质网膜分离后，继续在无细胞体系(不含RER小泡)中进行翻译，发现:短时间温育，即可得到成熟的分泌蛋白(无信号序列),而长时间的温育，得到的产物N-端有信号序列,这一结果证明了信号序列的功能。 为什么说多聚核糖体是研究内质网帮助蛋白质运输的好材料? ?信号序列的一般特征及早期信号假说 ?信号序列的一般特征 G.Blobel、B.Dobberstein、P.Walter和他们的同事在研究中还发现信号序列具有一些共同的特性:长度一般为15～